ICS 65.140 B 47 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T 23196—2008 蜂胶中阿魏酸含量的测定方法 液相色谱-紫外检测法 Determination of ferulic acid content in propolisHPLC-UV method 2008-12-31发布 2009-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23196—2008 前言 本标准的附录A、附录B和附录 C为资料性附录。 本标准由中华全国供销合作总社提出并归口。 本标准起草单位：杭州澳医保灵药业有限公司、中华全国供销合作总社蜜蜂产品标准化技术委员 会、中国农业科学院蜜蜂研究所、江苏出人境检验检疫局、南京大学、江苏老山生物科技有限公司。 本标准主要起草人：虞英民、胡晓岚、朱金梁、徐承智、周金慧、李公海、陈坤、练鸿振。 GB/T23196—2008 蜂胶中阿魏酸含量的测定方法 液相色谱-紫外检测法 1范围 本标准规定了蜂胶中阿魏酸含量的液相色谱测定方法。 本标准适用于蜂胶中阿魏酸含量的测定。 本标准的检出限：4μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD） 3原理 蜂胶中的阿魏酸经甲醇超声提取、沉淀、离心，再用0.45um滤膜过滤后得澄清液，经反相色谱柱 分离后，用液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。 4试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯；水为GB/T6682规定的一级水（为蒸馏水或同等纯度水）；未 指明用何种溶剂配制时，均指水溶液。 4.1甲醇：色谱纯。 4.20.085%磷酸溶液（体积分数）：量取0.85mL磷酸，用水定容至1000mL，经0.45μm滤膜过滤。 4.3乙腈：色谱纯。 4.5阿魏酸标准物质：纯度≥99%。 4.6阿魏酸标准储备溶液（200.0μg/mL）：准确称取10.0mg（精确到0.1mg）阿魏酸标准物质（4.5） 箱中冷藏保存两个月。 4.7阿魏酸标准工作溶液：分别吸取适量的阿魏酸标准储备溶液（4.6）1mL、2.5mL、5.0mL、 10.0mL、20.0mL、40.0mL、80.0mL至100mL容量瓶中，用70%甲醇（4.4）定容至刻度，配成 2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL、160.0μg/mL标准工作 溶液，现配现用。 5仪器与设备 5.1液相色谱仪：配有紫外检测器。 5.2分析天平：精确至0.1mg。 5.3过滤膜（聚偏氟乙烯微孔滤膜F型，Φ25mm）：0.45μm。 5.4超声仪。 1 GB/T 23196—2008 5.5离心机。 5.6匀浆仪。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 从全部蜂胶样品中取出约100g样品，装入洁净容器中分成两份，密封，并做标记。 6.2试样的保存 将试样于一10℃以下保存。 7测定步骤 7.1试样处理 0.5g（精确到0.1mg），置于50mL棕色容量瓶中，加人35mL甲醇（4.1），超声15min（频率为 25kHz，功率为50W），加人10mL水，摇匀，冷却到室温后，用水定容至刻度，混匀；以4500r/min的 转速离心20min，上清液用0.45um滤膜（5.3）过滤，滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定。 7.2色谱测定 7.2.1液相色谱条件 色谱柱：HypersilODS2,5μm，4.6mmX200mm。 b) 流动相：以0.085%磷酸溶液（4.2）为流动相A，以甲醇（4.1）为流动相B，以乙睛（4.3）为流动 相C，按表1进行梯度洗脱。 表1 梯度洗脱方法 时间/min 流速/（mL/min）0.085%磷酸溶液（流动相A)/%甲醇（流动相B)/% 乙睛（流动相C)/% 0~20 1. 0 83 17 20~21 1.0→1.5 83→0 0→100 17→0 21~36 1. 5 0 100 0 36~37 1. 5 80 100→0 0→17 37~52 1.5 83 0 17 c) 梯度洗脱方法：见表1。 d) 进样量：20μL。 检测波长：316nm。 e) f) 柱温：30℃。 7.2.2液相色谱测定 测定5个～7个系列浓度标准工作溶液（4.7）在上述色谱条件下的峰面积，以峰面积对相应浓度绘 制标准工作曲线，然后测定未知样品，用标准工作曲线对样品进行定量，使样品溶液中阿魏酸的响应值 在本法的线性范围内。在上述色谱条件下，阿魏酸的保留时间约为13.9min，阿魏酸标准物质色谱图和 含有阿魏酸的蜂胶样品色谱图参见图A.1、图A.2。 7.3平行试验 按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。 7.4空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤，应不干扰测定。 2 GB/T23196—2008 结果计算 试样中阿魏酸含量利用数据处理系统计算或按式（1)计算： X=cX50 .....1) m 式中： X——试样中阿魏酸的含量，单位为微克每克（μg/g)； 试样中阿魏酸的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）； 50——试样定容体积（mL）； m一一试样的质量，单位为克（g）。 计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 在对同一试样进行二次平行试验获得的二次测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。 本标准的研究资料参见附录B和附录C。 3