ICS 67.050 x 04 中华人民共和国国家标准 GB/T22989—2008 牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨、 头孢洛宁、头孢喹残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of cefapirin,cephalexin,cefalonium,cefquinome residues in milk and milk powder- LC-MS-MS method 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22989—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人：李学民、母健、曹彦忠、刘晓茂、钱小清、庞国芳。 GB/T22989—2008 牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨、 头孢洛宁、头孢喹残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨芋、头孢洛宁、头孢喹残留量的液相色谱-串联质谱 测定方法。 本标准适用于牛奶和奶粉中头抱匹林、头抱氨、头抱落宁，头抱喹残留量的测定 本标准牛奶的方法检出限：头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹为4.0μg/kg；奶粉的方法检 出限为：头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹为32μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2一2004ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987.MOD） 3原理 试样中四种头孢菌素类药物残留，用乙、磷酸盐缓冲溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联 质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。 4.1水:GB/T6682，一级。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙睛：色谱纯。 4.4 磷酸二氢钠（NaH,PO,）。 4.5 氢氧化钠：优级纯 4.6 乙酸。 4.7正已烷。 4.8乙睛-水溶液（3+1）：量取60mL乙睛（4.3）和20mL水充分混合。 置分层后，弃掉乙腈。 4.105mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠（4.5），用水溶解，定容至100mL。 4.110.10mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液：称取12.0g磷酸二氢钠（4.4），用水溶解，定容至1000mL， 1 GB/T22989—2008 然后用氢氧化钠溶液（4.10)调节至pH=8.5。 4.12标准物质：头孢匹林（CAS：24356-60-3）、头孢氨苄（CAS：16549-56-7）头孢洛宁（CAS：5575-21 3）、头孢喹（CAS：118443-89-3），纯度大于等于99%。 4.131.0mg/mL四种头孢菌素标准储备溶液：准确称取适量的每种标准物质（4.12），分别用水配制 成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液。储备液贮存在一18℃冰柜中。 4.14四种头孢菌素标准混合工作溶液：根据需要吸取适量的每种头孢菌素标准储备溶液（4.13），用水 制成适当浓度的混合标准工作溶液。 4.15OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg6mL。使用前依次用5mL甲醇（4.2）、5mL水和 10mL磷酸二氢钠缓冲溶液（4.11)预处理，保持柱体湿润。 4.16滤膜：0.2um。 5仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量0.1mg、0.01g。 5.3 固相萃取真空装置。 5.4贮液器：50mL。 5.5 微量注射器：25μL，100μL。 5.6均质器。 5.7 高速冷冻离心机：带有50mL具塞离心管，转速达到10000r/min以上。 5.8 刻度样品管：5mL，精度为0.1mL。 旋转浓缩仪。 5.10氮气浓缩仪。 6试样制备与保存 6.1试样的制备 从全部样品中取出有代表性样品药1kg，充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封后作 为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2试样的保存 将试样于一18℃保存。 7测定步骤 7.1试样溶液的提取 7.1.1牛奶 称取5g试样（精确到0.01g）置于50mL离心管中，加入20mL乙睛（4.3），使用均质器（5.6）均 离心管中。用15mL乙睛-水溶液（4.8）重复提取一次，合并两次的提取液，并加人10mL乙睛饱和的 正已烷（4.9），振荡1min，弃掉正已烷。把提取液移至100mL鸡心瓶中，在40℃C用旋转浓缩仪（5.9） 旋转蒸发除去乙睛。 7.1.2奶粉 称取0.5g试样（精确到0.01g）置于50mL离心管中，加入4.0mL水，使奶粉充分溶解，加人 1）OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T22989—2008 20mL乙睛（4.3），使用均质器（5.6）均质1min，提取液使用高速冷冻离心机（5.7）在10℃10000r/min离 取液，并加人10mL乙腈饱和的正已烷（4.9），振荡1min，弃掉正已烷。把提取液移至100mL鸡心瓶 中，在40℃用旋转浓缩仪（5.9）旋转蒸发除去乙睛。 7.2试样溶液的净化 向已除去乙睛的样品溶液中加人20mL磷酸二氢钠缓冲溶液，然后用氢氧化钠溶液（4.10）调节至 pH=8.5。把样品提取液移至下接OasisHLB固相萃取柱（4.15）的贮液器中，以3mL/min的流速通 过固相萃取柱，先用5mL磷酸二氢钠缓冲溶液洗涤鸡心瓶并过柱，再用2mL水洗柱，弃去全部流出 液。用2mL乙腈洗脱，收集洗脱液于刻度样品管（5.8）中，在40℃氮气浓缩仪（5.10）吹干，用2mL水 溶解残渣，摇匀后，过0.2μm滤膜（4.16），供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3空白样品添加标准混合工作溶液的制备 7.3.1牛奶 分别准确移取适量四种头孢菌素标准混合工作溶液（4.14），添加到5.0g样品中，按照7.1、7.2步 骤操作，制得头孢匹林、头孢氨、头孢洛宁、头孢喹浓度分别为4.0μg/kg、8.0μg/kg、16μg/kg、 40μg/kg四个样品添加标准混合工作溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3.2奶粉 骤操作，制得头孢匹林、头孢氨、头孢洛宁、头孢浓度分别为32ug/kg、64μg/kg、128ug/kg、 320μg/kg四个样品添加标准混合工作溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： 色谱柱：ZORBAXSB-Cis，3.5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； 流动相组成、流速及梯度程序见表1； c) 柱温：30℃； d) 进样量：20μL。 表1流动相梯度程序及流速 时间/min 流速/(μL/min) 水（含0.1%乙酸）/% 乙/% 0.00 200 95.0 5.0 2.00 200 95.0 5. 0 2.01 200 40.0 60.0 8.00 200 40. 0 60.0 8.01 200 95.0 5. 0 15. 00 200 95. 0 5. 0 7. 4. 2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a） 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测； 电喷雾电压：5500V； e) 雾化气压力：0.055MPa； 3