ICS 65. 020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28073—2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of arabis mosaic virus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28073—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：廖富荣、于翠、张永江、陈红运、林石明、陈青、黄蓬英、沈建国、吴媛 GB/T28073—2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。 本标准适用于植物种子、鳞球茎、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定。 2南芥菜花叶病毒基本信息 中文名：南芥菜花叶病毒。 英文名：arabismosaicvirus。 异名：arabismosaicnepovirus;hopnettleheadvirus（啤酒花荨麻病病毒）；rhubarbmosaicvirus（大 黄花叶病毒）；raspberryyellowdwarfvirus（悬钩子黄矮病毒）；ashringandlinepatternviurs（白腊树 环线状病毒）；rhabarber-mosaik-virus（大黄花叶病毒）；forsythiayellownetvirus（连翘黄网状病毒）； jasmineyellowblotchvirus（茉莉黄斑病毒）。 英文缩写：ArMV。 属豇豆花叶病毒科Comoviridae，线虫传多面体病毒属Nepovirus。 南芥菜花叶病毒的其他信息参见附录A。 3方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、反转录和体外DNA扩增技 术的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)进行检测鉴定。 4主要仪器设备 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备： 微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳 槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计等和各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、 100 μL,20 μL,10μL,2 μL)。 5检测与鉴定 5.1DAS-ELISA检测 把0.5g~1.0g样品充分研磨或在液氮中研磨，按1：10比例加入样品提取缓冲液，转移到5mL 离心管中，8000r/min离心5min，上清液作为DAS-ELISA的检测提取液 设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料（如：种子或叶片）应该尽量与所检测 样品类型相一致。具体操作过程见附录B。 注：提取液在3h内使用，否则保存在4℃中。 1 GB/T28073—2011 5.2 RT-PCR检测 分别提取检测样品的总RNA，然后用RT-PCR检测。用健康的植物组织作阴性对照，用感染 ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。 具体操作过程见附录C。 5.3实时荧光RT-PCR检测 分别提取检测样品的总RNA，反转录合成cDNA后用实时荧光PCR检测。用健康的植物组织作 阴性对照，用感染ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。 具体操作过程见附录D。 5.4序列测定 将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核 苷酸序列与已知的ArMV相应序列进行比对，如果翻译后氨基酸序列与已知的ArMV相应序列同源 性大于75%则判定为ArMV序列，小于75%则判定为非ArMV序列。 注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：//www.ncbi.nlm，nih.gov/BLAST/ 6结果判定与报告 6.1结果判定 当产生以下检测结果时，则判定为检出ArMV： 一当DAS-ELISA检测、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测，其中有两种方法检测结果呈阳 性时，判定为检出ArMV； 一当RT-PCR检测结果呈阳性，测定的序列为ArMV序列，则判定为检出ArMV。 6.2结果记录与保存 记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸 光值的数据报告，RT-PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT-PCR检测结果保存采集的数据，序列 测定结果保存测序报告图。 2 GB/T28073—2011 附录A （资料性附录） 南芥菜花叶病毒简介 A.1分布 欧洲：奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、匈牙利、 爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐 克、斯洛文尼亚、瑞典、瑞士、英国、乌克兰和南斯拉夫。 亚洲：日本、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗 非洲：南非。 北美洲：加拿大、美国。 大洋洲：澳大利亚、新西兰。 A.2形态特征 该病毒属线虫传多面体病毒，病毒粒体为等轴对称二十面体，直径约30nm，为双分体病毒，含有 两条相对分子质量分别为2.4X10和1.4X10°的单链RNA。超速离心后分为T（53S），M（93S）和 B(126S)三个组分。该病毒具有一个外壳蛋白，相对分子质量为54kDa。 A.3寄主范围及症状 ArMV可侵染174属215种植物。主要为害的作物有大麻（Cannabissatiua）、啤酒花（Humulus lupulus）、黄瓜（Cucumissativus）、西葫芦（Cucurbitapepo）莴苣（Lactucasativa）、草莓（Fragaia ananassa）、葡萄（Vitisvinifera）、香石竹（Dianthuscaryophyllus）、水仙（Narcissustazetta）、蔷薇 （Rosamultiflora）、草木（Melilotussuaveolens）、郁金香（Tulipagesneriana）、芹菜（Apiumgraveo- lens）、薄荷（Menthasppiperita）、丁香（Syringaoblata）、大豆（Glycinemar）、甜菜（Betavulgaris）、马 铃薯（Solanumtuberosm）、烟草（Nicotianatabacum）、番茄（Lycopericonesculentum）、菜豆（Phaseolus oulgaris）、豇豆（Vignaunguiculata）、蚕豆（Viciafaba）豌豆（Pisumscatwum）、甜瓜（Cucumis melo）、花椰菜（Brassica oleraceaL,var.botrytis）、菠菜（Spinacia oleracea）、胡萝卜（Daucus carota）等。 ArMV引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸型、耳突。症状随着寄主植物、病 毒的分离物、栽培条件、季节和年份的不同而改变。有时候ArMV的侵染是隐症的，并不会在寄主植物 上表现症状。 在鉴别寄主上产生的症状： a）昆诺藜（Chenopodiumquinoa）和苋色藜（C.amaranticolor）接种叶上形成褪绿的局部斑点，然 后形成系统性斑驳； b) 黄瓜（C.satiuus）：接种的子叶上产生褪绿的局部斑点，以及系统性脉带或黄色斑点； c)） 菜豆（P.uulgaris）：产生坏死的局部枯斑、系统性坏死和畸型； 矮牵牛（Petuniahybrida）：产生局部坏死斑点或小的坏死环和系统性环斑，以及线状斑或 明脉。 3