ICS 65. 020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28070—2011 黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Tilletia walkeri Castlebury &Carris 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28070—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局，深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：章桂明、程颖慧、王颖、陆清、凌杏元、龙海、陈枝楠、刘新娇、仲建忠、杨伟东 缪建。 GB/T28070—2011 黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了黑麦草腥黑粉菌的检疫鉴定方法和检疫鉴定流程，明确了取样和样品保存方法。 本标准适用于黑麦草传带黑麦草腥黑粉菌的检测以及小麦中污染的黑麦草腥黑粉菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18085植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3黑麦草腥黑粉菌基本信息 中文名：黑麦草黑粉菌。 学名：TilletiawalkeriCastlebury&Carris(简称TW)。 英文名：ryegrass bunt。 属真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、黑粉菌纲Ustomycetes、黑粉菌目Ustilaginales、腥黑粉 菌科Tilletiaceae、腥黑粉菌属Tilletia。 病粒及附着于健康种子表面的冬孢子是病原菌进行远距离传播的主要途径，由于该病局部侵染的 特性，在收获期间很难有效的清除混杂于健康种子中的病粒，因而病粒可随同小麦或黑麦草的资源性引 种或科研性引种而进行远距离传播。 黑麦草腥黑粉菌的其他信息参见附录A。 4方法原理 根据黑麦草腥黑粉菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征，应用相关仪器，包括显微镜和 PCR仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定。 5 检疫鉴定流程 检疫鉴定流程见图1。 1 GB/T280702011 样品 洗涤 镜检 未发现疑似TW孢子 发现疑似TW孢子 查找菌瘦 单个冬孢子分子检测 冬孢子萌发 发现疑似TW菌瘦 米发现疑似TW菌瘦 (附录D) 判定为不带TW孢了 孢了培养物分了检测 形态学鉴定 进行形态学鉴定或 (附录E、附录F、附录G) (附录A、附录B、附录C) 分子检测 实时荧光PCR检测 序列测定与比对 常规PCR检测 检 结果判定 结果判定 菌瘦或洗涤检疫 菌矮或洗涤检疫 菌瘦或洗涤检疫孢 结果呈阳性 孢子平均值介于 结果呈阴性 子平均值小于25,um 孢子平均值介于 25m30um或 或大于35μm判定为 判定为TW 判定为非TW 30 μm--31 μm 判定为TW 非TW 间做分子检测 图1 黑麦草黑粉病菌检疫鉴定流程图 6取样方法 散装船运黑麦草种子及小麦参照GB/T18085取样方法进行取样。 袋装黑麦草及小麦参照SN/T2122取样方法进行取样。 2 GB/T28070—2011 7主要仪器设备和试剂 7.1 主要仪器设备 7. 1. 1 摇床。 7. 1. 2 显微镜。 7. 1. 3 纯水器。 7. 1. 4 测序仪。 7.1. 5 电泳仪。 7. 1. 6 低温冰箱。 7. 1.7 显微操作仪。 7.1. 8 超净工作台。 7. 1. 9 高压灭菌锅。 7. 1. 10 光照培养箱。 7. 1. 11 旋涡振荡器。 7. 1. 12 普通离心机。 7.1. 13 冷冻干燥机。 7. 1. 14 凝胶成像仪 7. 1. 15 核酸蛋白分析仪。 7. 1. 16 PCR仪（常规PCR仪、实时荧光PCR仪）。 7. 1. 17 破壁针（具有平截切面的针，能将孢子压碎）。 7. 1. 18 培养Ⅲ(9 cm)。 7. 1. 19 筛网（40μm、20μm）。 7. 1. 20 孔径100μm的毛细管 7. 1. 21 锥形瓶（250mL、500mL）。 7.1. 22 盖玻片（18mm×18mm）。 7.1.23 PCR反应管(0.2mL,0.5mL)。 7. 1. 24 载玻片(25mm×76mm),厚(0.8mm~1.0mm)。 7. 1. 25 ( 000 1~d 001' 002~ g' 01~d 1) d1 7.1. 26 可调微量移液器（2μ，10μ，20μ,100μL,200μ，1000μ） 7.2 主要试剂 SAC 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 7. 2. 1 三氯甲烷。 7.2. 2 异戊醇。 7.2. 3 异丙醇。 7. 2. 4 醋酸钠。 7.2. 5 甲酰胺。 7. 2. 6 70%乙醇。 7.2.7 无水乙醇。 7. 2. 8 Tris饱和酚。 7. 2. 9 Taq酶。 3