ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33115—2016 水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofNarcissuslateseasonyellowsvirus 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国宁波出入境检验检疫局、福建农林大学。 本标准主要起草人:沈建国、李敏、蔡伟、李桂芬、张永江、虞赟、于文涛、郭立新、高芳銮、吴祖建。 ⅠGB/T33115—2016 水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了水仙迟季黄化病毒(Narcissuslateseasonyellowsvirus)的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带水仙迟季黄化病毒的水仙及水仙产品检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964 植物病毒检测规范 SN/T3457 植物病毒分子生物学检测规范 3 水仙迟季黄化病毒基本信息 中文名:水仙迟季黄化病毒。 学名:Narcissuslateseasonyellowsvirus,缩写:NLSYV。 分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae),马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。 水仙迟季黄化病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 水仙迟季黄化病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 5 仪器、用具及试剂 5.1 仪器 高速冷冻离心机、电子天平、PCR仪、荧光PCR仪、水平电泳系统、-20℃低温冰箱和-80℃超低 温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶标 仪等。 5.2 用具 酶联板、可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)和可调移液器头、离心管、研 钵等。 5.3 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。PTA-ELISA检测 1GB/T33115—2016 试剂见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D。 6 抽样和样品制备 6.1 抽样 抽样方法按照SN/T2122中规定执行。 6.2 样品制备 分别按照有症和无症进行样品制备,具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行。 7 检测鉴定 7.1 PTA-ELISA检测 以含NLSYV材料作为阳性对照,以不含NLSYV的健康植物组织作阴性对照,同时以样品提取缓 冲液作为空白对照,具体操作见附录B。 7.2 RT-PCR检测 以含NLSYV材料作为阳性对照,以不含NLSYV的健康植物组织作阴性对照,同时以ddH2O代 替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作 见附录C。如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行。 7.3 实时荧光RT-PCR检测 以含NLSYV材料作为阳性对照,以不含NLSYV的健康植物组织作阴性对照,同时以ddH2O代 替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA,进行实时荧光RT-PCR检测,具体操作见附录 D。如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行。 8 结果判定 样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行: ———PTA-ELISA初步筛检,若检测结果为阴性,则判定样品不携带NLSYV;若检测结果为阳性, 则采用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行验证。 ———若验证结果为阳性,则判定样品携带NLSYV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带 NLSYV。 9 样品保存与结果记录 9.1 样品保存 经检测确定携带NLSYV的样品应保存在适合的条件下以备复核。种苗、叶片等样品保存在 -80℃冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少6个月。 9.2 结果记录 记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。PTA-ELISA 检测应有酶联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片。 2GB/T33115—2016 附 录 A (资料性附录) 水仙迟季黄化病毒相关资料 A.1 寄主范围 寄主范围较窄,已报道的寄主为水仙(NarcissustazettaL.)。 A.2 病害症状 侵染水仙后引起叶片、花茎上出现窄长的褪绿条纹或椭圆状斑块等症状(参见图A.1)。 图A.1 NLSYV侵染水仙后引起的症状 A.3 分布地区 主要分布于英国、荷兰、新西兰、中国等国家。 A.4 传播途径 主要由桃蚜(Myzuspersicae)传播。 A.5 粒体形态 病毒粒体为线条状,大小约750nm×12nm(参见图A.2)。 注:引自http://www.dpvweb.net。 图A.2 NLSYV病毒粒体 3GB/T33115—2016 A.6 病毒基因组 正义单链RNA病毒,全长约9651bp。 4GB/T33115—2016 附 录 B (规范性附录) 酶联板捕获抗原酶联免疫吸附测定(PTA-ELISA) B.1 试剂 B.1.1 包被缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g 叠氮化钠(NaN3) 0.2g 加入蒸馏水900mL,用HCl调节pH值到9.6,然后加蒸馏水至1L,4℃储存。 B.1.2 磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4) 氯化钠(NaCl) 8.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 1.15g 氯化钾(KCl) 0.2g 叠氮化钠(NaN3) 0.2g 加入900mL蒸馏水溶解,用NaOH或HCl调节pH值到7.4,然后加水至1L。 B.1.3 PBST 每升PBS中加入0.5mL的吐温-20。 B.1.4 抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液 三羟基氨甲烷盐酸盐(Tris-HCl) 13.0g 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 2.0g 氯化钠(NaCl) 9.0g 吐温-20(Tween-20) 25.0mL 脱脂奶粉 50.0g 加入蒸馏水定容至1L,4℃储存。 B.1.5 底物(pNPP)缓冲液(pH9.8) 氯化镁(MgCl2) 0.1g 叠氮化钠(NaN3) 0.2g 二乙醇胺[HN(CH2CH·OH)2] 97.0mL 溶于800mL蒸馏水中,用HCl调节pH值至9.8,蒸馏水定容至1L,4℃储存。 B.1.6 抗体 病毒抗体:水仙迟季黄化病毒抗体。 酶标抗体:碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG。 5GB/T33115—2016 B.2 操作步骤 B.2.1 样品制备 称取0.5g~1.0g待测样品,按1∶10(质量∶体积)比例加入包被缓冲液,用研钵研磨成浆, 8000g离心5min,上清液即为制备好的检测样品,保存于-20℃冰箱。阴性对照、阳性对照作相应的 处理或按说明书进行。 B.2.2 包被抗原 加入制备好的检测样品,同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。每个处理至少设2个重复。 100μL/孔,37℃孵育1h或4℃冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,用PBST洗涤4次~6次。 B.2.3 加病毒抗体 将病毒抗体按说明稀释至工作浓度,加入到酶联板的孔中,100μL/孔,37℃孵育1h,倒去酶联板 孔中溶液,用PBST洗涤4次~6次。 B.2.4 加酶标抗体 将酶标抗体按说明将稀释至工作浓度,加入到酶联板的孔中,100μL/孔,37℃孵育1h,倒去酶联 板孔中溶液,用PBST洗涤4次~6次。 B.2.5 加底物 将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),按100μL/孔,加入到酶联板 中,室温避光孵育。 B.2.6 吸光值的测定 阳性对照孔显色后,用酶联仪于405nm处读OD值。 B.3 结果判断 在满足阴性对照孔的OD405值<0.15、阳性对照孔的OD405值/阴性对照孔的OD405值>5~10,孔的 重复性基本一致的质量要求后,样品OD405值/阴性对照OD405值>2,判为阳性。样品OD405值/阴性对 照OD405值在阈值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证。样品OD405值/阴性对 照OD405值<2,判为阴性。 6GB/T33115—2016