ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33121—2016 玉米褐条霜霉病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofSclerophthorarayssiaeKenneth, KaltinetWahlvar.zeaePayaketRenfro 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国中山出入境检验检疫 局、中华人民共和国福清出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:王宏毅、陈定虎、黄智辉、林谷圆、郑万里、黄蓬英、方志鹏、林石明、严进。 ⅠGB/T33121—2016 玉米褐条霜霉病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了玉米褐条霜霉病菌(SclerophthorarayssiaeKenneth,KaltinetWahlvar.zeaePayak etRenfro)的形态学检疫鉴定方法,明确了样品现场采集、实验室鉴定、标本制作和样品保存等方法。 本标准适用于玉米(Zeamays)植株及其谷物中的玉米褐条霜霉病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T18085—2000 植物检疫 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 GB/T18086—2000 植物检疫 烟霜霉病菌检疫鉴定方法 SN/T1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T2504 进出口粮谷检验检疫操作规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 孢子囊 sporangium 孢囊梗顶端膨大,并在下方生出横隔与菌丝分开形成囊状结构的无性繁殖器官。 注1:成熟后易脱落,并在囊内形成游动孢子。 注2:孢子囊的英文复数形式为“sporangia”。 3.2 孢囊梗 sporangiophore 支持孢子囊的菌丝分枝。 3.3 藏卵器和雄器 oogonium&antheridium 生殖菌丝生出两个大小不同的异形配子囊,大的为雌配子囊,能在囊内形成一个雌配子(卵子),即 为藏卵器;小的能产生雄配子,即为雄器。 注1:玉米褐条霜霉病菌的藏卵器与雄器同体。 注2:藏卵器与雄器的英文复数形式分别为“oogonia”“antheridia”。 3.4 卵孢子 oospore 藏卵器中的卵子与雄器的雄配子相配合后形成。 4 病原菌基本信息 中文名:玉米褐条霜霉病菌,又称褐条指疫霉菌玉蜀黍变种。 1GB/T33121—2016 英文名:Brownstripedownymildewofcorn,简称BSDM。 学名:SclerophthorarayssiaeKenneth,KaltinetWahlvar.zeaePayaketRenfro,1967。 分类地位:藻菌界Chromista,卵菌门Oomycota,卵菌纲Oomycetes,霜霉目Peronosporales,霜霉 科Peronosporaceae,指疫霉属SclerophthoraThirumalachar,Shaw&Narasimhan,1953,褐条指疫霉 菌SclerophthorarayssiaeKenneth,KoltinetWahl,1964。 传播途径:该病菌可以由被病原菌污染过的种子,或带病植株,以及混杂于货物中的病残体作远距 离传播。 玉米褐条霜霉病菌的其他信息参见附录A。 5 方法原理 本标准主要以玉米褐条霜霉病菌的为害症状,病原菌的孢囊梗、孢子囊和卵孢子形态特征为鉴定依 据。玉米褐条霜霉病菌的为害症状参见附录B和附录C,病原菌的孢子囊和卵孢子形态特征见附录D。 6 仪器设备和试剂 6.1 仪器设备和器具 6.1.1 仪器设备 生物显微镜(配带100倍油镜且最大观察倍数不低于1000倍,配备图像采集系统和图像分析软 件,或至少配带照相功能和镜台测微尺)、体视显微镜(总放大倍数不低于50倍)、超净工作台、振荡器、 高压灭菌锅。 6.1.2 器具 医用解剖刀、解剖针、眼科手术剪刀、胶头滴管、微量可调加样器(2μL~20μL)、枪头(2μL~ 20μL)、滤筛(孔径为0.18mm)、烧杯(250mL)、离心管(10mL或20mL)、三角瓶(500mL)、培养皿 (直径为150mm~200mm)。 6.2 试剂和材料 6.2.1 试剂 无菌水、75%乙醇溶液、吐温20、10%氢氧化钠、席尔氏缓冲液(配制方法按GB/T18085—2000执 行)和0.05%苯胺蓝(棉蓝)乳酚油(配制方法按GB/T18086—2000执行)。 6.2.2 材料 无菌滤纸、铝箔纸、Parafilm膜、载玻片和盖玻片。 7 检疫和鉴定 7.1 检疫 7.1.1 现场检疫 7.1.1.1 植株症状检查 现场对玉米植株的检疫,要在光线充足处,仔细检查植株叶片是否带有可疑症状,参见附录B和附 2GB/T33121—2016 录C。 7.1.1.2 种子和原粮的检疫 现场对玉米种子和原粮的检疫,要在检疫的现场仔细检查种子或原粮中是否夹带有可疑症状叶片 及其他病残体,参见附录B和附录C。 7.1.2 抽取样品 对于植株样品的扦取,主要按照SN/T1157执行;对于种子样品的扦取,主要按照SN/T2122执 行;对于原粮样品的扦取,主要按照SN/T2504执行。 7.1.3 送检 将现场检疫获取的抽取样品,连同现场发现的病残体,送实验室作进一步的室内检疫及玉米褐条霜 霉病病原鉴定。 7.2 实验室病原菌观察、记录 7.2.1 直接镜检 对于现场送检的带有可疑症状病叶或病残体,置于体视显微镜下观察,用解剖针挑取叶片病斑背面 上的霉状物,放在加有1滴约10μL席尔氏缓冲液的载玻片上,盖上盖玻片,先在显微镜下用40倍物镜 观察有无病菌的孢囊梗、孢子囊,再用100倍油镜记录其形态特征,测量其大小,并拍照留存。 7.2.2 保湿培养 对于未带有可疑症状的病叶或病残体,用流水充分冲洗,用75%乙醇溶液浸泡1min进行表面灭 菌,无菌水冲洗3次,置于灭菌的培养皿(垫有充分吸取无菌水的三层无菌滤纸)中,用Parafilm膜封口 后,置于21℃培养箱中,在相对湿度100%、黑暗条件下保湿培养过夜,诱发孢子囊产生后,按7.2.1方 法镜检观察、测量和病原鉴定。 7.2.3 组织透明法检验卵孢子 对于病斑上霉状物稀少的老病叶,用眼科手术剪刀剪成约10mm×10mm,置于小烧杯中,加适量 10%氢氧化钾溶液,煮沸5min~10min至叶组织透明,平整放入用胶头滴管加上1滴0.05%苯胺蓝 (棉蓝)乳酚油作浮载剂的载玻片上,置于显微镜下,用40倍物镜或20倍物镜逐片观察有无卵孢子。如 发现有卵孢子,用100倍油镜记录其形态特征,测量其大小,并拍照留存。 7.2.4 洗涤检查 对于玉米种子和原粮,每份样品充分混匀后,随机取100g置于500mL三角瓶内,加入适量蒸馏水 (约150mL)浸软后,再用胶头滴管加入1滴~2滴吐温20,用铝箔纸将三角瓶口封住,用振荡器激烈振 荡5min,将洗涤液经滤筛过滤到烧杯后,倒进离心管,以转速1000r/min离心5min,必要时可重复离 心1次,将上层清液全部倒去,最后用胶头滴管加入数滴席尔氏缓冲液至沉淀液充分混匀,再用微量可 调加样器吸取15μL沉淀液置载玻片上,盖上盖玻片,按7.2.1方法镜检观察有无玉米褐条霜霉病菌的 孢子囊,每份样品洗涤液至少检查20个玻片。在镜检时,如发现孢子囊干瘪变形,将镜检玻片封固后, 连同沉淀液放置于5℃的冰箱中过夜,等孢子囊形态恢复后,继续按7.2.1方法镜检观察和测量。 3GB/T33121—2016 8 病原菌鉴定特征 玉米褐条霜霉病菌鉴定特征:孢囊梗短小,小于5μm,由气孔下的菌丝伸出,能形成2个~6个孢 子囊;孢子囊无色,卵圆至圆柱形,顶部有镜片状孔口,脱落,有一小柄,大小(29μm~66.5μm)× (18.5μm~26μm);孢子囊萌发时产生4个~8个透明、球形的游动孢子,直径7.5μm~11μm。藏卵 器分散产生在叶肉中,近球形,壁薄,无色至淡黄色,直径33μm~44.5μm,每个藏卵器附有1个~2个 侧生的雄器;卵孢子中等大小,球形至近球形,光滑而发亮,与藏卵器壁愈合,直径29.5μm~37μm。 玉米褐条霜霉病菌形态特征图见附录D。 9 结果判定 经实验室的进一步检疫和病原观察、测量,如果检出的病原菌孢囊梗、孢子囊和卵孢子形态特征与 鉴定特征相符,则检出的病原菌可鉴定为玉米褐条霜霉病菌,样品判定为阳性样品。 10 样品保存 10.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出玉米褐条霜霉病菌的种子或原粮样品,应保存于 4℃的冰箱中,或存放于具防虫、防鼠、防霉变和防污染的环境中真空密封保存,保存期约6个月,以备 复核;另外,对检出病菌的玉米植株或病残体,要制作成干标本(制作方法参见附录E),可长期保存。 以上样品保存期满后,除少量有必要作长久保存的样品外,其余须经高压灭菌后方可作弃置处理。 10.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法、结果、症状和病菌显微照片 等,并有实验人员和审