ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33124—2016 杨树叶锈病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofMelampsoramedusaeThümen 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫 局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:杜宇、岳亮亮、王宏毅、黄振、曹云华、梅华全、邓裕亮、吴品姗、周剑、段禄华。 ⅠGB/T33124—2016 杨树叶锈病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了杨树叶锈病菌MelampsoramedusaeThümen,1878的形态学鉴定方法。 本标准适用于白杨PopulusbalsamiferaL.、黑棉杨Populusbalsamiferasubsp.trichocarpa (Torr.&Gray)Brayshaw、美洲黑杨PopulusdeltoidsMars以及落叶松属Larixspp.、松属Pinus spp.、美国花旗松Pseudotsugamenziesii(Mirb.)上的杨树叶锈病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2758 美国圆柏苹果锈病菌检疫鉴定方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 术语和定义 SN/T2758界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 冬孢子 teliospore 由双核菌丝的顶端细胞发育成的有性休眠孢子,该类孢子产生担子。 3.2 冬孢子堆 telia 由冬孢子聚集而成。 注:冬孢子堆多数分布在叶背,有些穿过叶表面。 3.3 夏孢子 urediniospore 由锈孢子产生的双核菌丝体上产生的重复性营养阶段孢子。 注:夏孢子开始是在寄主体内生活,然后穿破表皮向外扩散。进入细胞后,以单细胞的形态,生出密集的刺状或泡 状的小棘;上有数个发芽孔,以芽管发芽,同样产生形成夏孢子的菌丝或冬孢子的菌丝。 3.4 夏孢子堆 uredinia 由锈孢子萌发形成的双核菌丝体上产生的第三种孢子堆。 注:栅锈菌属真菌的夏孢子堆没有包被,但有周生侧丝。 4 杨树叶锈病菌基本信息 中文名:杨树叶锈病菌 英文名:Poplarrust 学名:MelampsoramedusaeThümen,1878 1GB/T33124—2016 异名:Uredomedusae(Thümen)Arthur,(1906) 无性型:CaeomafaullianaHunter(锈孢子器状态) 分类地位:真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、冬孢菌纲Teliomycetes、锈菌目Uredinales、栅 锈菌科Melampsoraceae、栅锈菌属Melampsora。 传播途径:带菌杨树、转主寄主松属和落叶松属植物及美国花旗松Pseudotsugamenziesii(Mirb.) 是远距离传播主要途径;锈孢子和夏孢子等可随风较长距离地扩散传播。 杨树叶锈病菌的生物学特性和地理分布等其他信息参见附录A。 5 方法原理 主要以夏孢子的形态特征为鉴定依据,性孢子器、锈孢子器、冬孢子和担子等的形态特征为辅助鉴 定依据。 6 仪器设备和试剂 6.1 仪器设备和工具 生物显微镜(物镜最大放大倍数100倍,备测量软件或镜台测微尺)、体视显微镜(倍数不低于 50倍)、超净工作台、滴管、医用解剖刀、解剖针、高压灭菌锅、载玻片、盖玻片、三角瓶(250mL)。 6.2 主要试剂 按照SN/T2758执行。 7 检测和鉴定 7.1 症状检查与取样 7.1.1 症状检查 7.1.1.1 杨树上的症状检查 主要检查杨树叶片是否有淡黄斑,特别是叶片背面,从植株的下层叶片开始,逐步向上层叶片逐一 检查,其为害症状参见A.3。 7.1.1.2 针叶树上的症状检查 主要检查松针上是否有褪色、腐烂,特别是检查掉落的针叶上是否有褪色和腐烂等症状,其为害症 状参见A.3。 7.1.2 取样 如发现病菌为害症状,取为害样品送实验室检测。如果症状不明显或未发现症状,随机取样,方法 按照SN/T2122执行。 7.2 样品制备 7.2.1 生长观察 7.2.1.1 如果在寄主上的症状不明显时,将取得的有疑似症状的植株放置于有隔离条件的温室中,直到 2GB/T33124—2016 产生夏孢子止(参见A.4)。 7.2.1.2 如果是转主寄主,需要将感病松针放置于美洲黑杨或杨树叶锈病菌其他寄主树苗周围,杨树叶 锈病菌的寄主树苗需要种植于有隔离条件并具备人工吹风的温室中,待锈孢子侵染寄主,产生夏孢子止 (参见A.4)。 7.2.2 制片 7.2.2.1 切片法 采用徒手切片法将杨树叶片或针叶切成薄片(1.0μm~1.5μm),放在载玻片的水滴中,加一滴乳酚 油作浮载剂,加盖玻片,备镜检。 7.2.2.2 针刺法 用针直接刮取孢子堆上的孢子粉置于离心管中,加入适量的席尔氏浮载剂制成孢子悬浮液,用可调 微量加样器吸取适量(以加盖玻片后悬浮液不外溢为宜)悬浮液至载玻片上,加盖玻片,制成玻片,备 镜检。 7.3 形态鉴定 7.3.1 性孢子器 性孢子器主要是附着在叶面上,包被于角质层下,散生,淡黄色,长40μm~55μm。 7.3.2 锈孢子器 锈孢子器着生在叶背,裸生,淡黄色,大量孢子器堆生,直径0.5mm;锈孢子链珠状,近球形,直径 17μm~22μm,孢子壁无色,厚2.5μm~3μm,表面略粗糙。 7.3.3 夏孢子 夏孢子堆着生于叶表皮下,大多数突出于叶背面,少量突出叶表,金黄色至橙色,直径150μm~ 250μm,在一些寄主上主要分布在上层叶表,表现为淡色小斑;夏孢子卵圆形至圆形,有时近梨形,端部 圆形,基部平截,内容物金黄色,壁无色;长(23μm~37μm)×(13μm~21μm),端部厚1μm~ 1.5μm,基部厚2μm,两侧厚3μm~5.5μm;壁上被棘,长8μm~12μm,超过腰部的一半的区域光滑, 极少数几乎整个腰部全部光滑;小棘长1μm~1.5μm,宽0.5μm~0.7μm,棘间距1.5μm~3μm,临近 光滑区域,小棘变小。发芽孔几乎不可见,孢子上有2~4处可萌芽。夏孢子萌发的菌丝,从夏孢子堆上 四散开来,呈头状丝序,柄长70μm,宽4μm~6μm,顶端近圆形,直径14μm~17μm,或倒卵圆形,少 数棍棒形,(18μm~22μm)×(12μm~16μm),壁厚度均匀,1.5μm~3μm,少数在端部可厚达4μm。 杨树叶锈病菌夏孢子的形态特征见附录B。 7.3.4 冬孢子 在老叶上,冬孢子堆与夏孢子堆混合,在落叶上大量发生,主要分布在叶背面,在严重感病时,也分 布在叶面,开始时呈淡琥珀棕色,变黑后,呈深红棕色,干枯时呈近黑色,冬孢子堆微突出,在表皮层下, 近圆形至规则形,3个~4个或更多的孢子堆聚集成1个较大的孢子堆,单个冬孢子堆直径90μm~ 350μm。有些冬孢子堆穿过叶面,在叶两面上产生冬孢子。冬孢子是单细胞,近圆柱形,横切面呈圆形 至不规则形,直径30μm~40μm,壁厚11μm~14μm,有时在端部壁厚2μm~2.5μm,包被于寄主表 皮层下。 3GB/T33124—2016 7.3.5 担子 担子在越冬冬孢子堆的表面,产生于冬孢子端部的小孔,呈一层金色,着生于短柄上,短柄宽2μm ~2.5μm,长2μm~3μm;担子圆柱形,端圆;由4个细胞组成,直或微曲,(40μm~65μm)×(7μm~ 8μm);内容物淡金黄色,壁无色。担子细胞具柄,基部宽2μm~2.5μm,长10μm~12μm,向端部渐 窄。担孢子球形,直径7.5μm~11μm,孢子上有1小突起与小梗联接,内容物淡金黄色,壁无色;通常, 从长10μm~12μm的小梗上长出次生的小梗上的担孢子较小。 7.4 与近似种的区别 杨树叶锈病菌的近似种是阿尔伯塔杨树叶锈病菌MelampsoraalbertensisArthur,1906和青杨叶 锈病菌Melampsoralarici-populinaKleb,1902。其区别参见附录C。 8 结果判定 如果检出样品上的病菌形态与7.3的描述相符,则判定为杨树叶锈病菌。 9 样品保存 9.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出杨树叶锈病菌的样品应保存于5℃~8℃冰箱中, 保存期1个月,以备复核。另外,可制作干标本(参见D.1),长期保存。该类样品保存期满后须经高压 灭菌后方可处理。 9.2 夏孢子的保存 采用超低温保存法(参见D.2)进行菌株保存。 9.3 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法、结果、症状和病菌显微照片 等,并有实验人员和审核人员签字。 4GB/T33124—2016 附 录 A (资料性附录) 杨树叶锈病菌的其他信息 A.1 地理分布 欧洲:比利时、法国、葡萄牙、西班牙。 亚洲:日本。 非洲:南非、津巴布韦。 北美洲:加拿大、墨西哥、美国。 南美洲:阿根廷、玻利维亚、巴西、智利、乌拉圭。 大洋洲:澳大利亚、新西兰。 A.2 寄主范围 主要寄主:白杨Populu