ICS 67.050 SN CCS X 04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5438—2022 出口乳粉中核苷酸含量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of nucleotide in milk powder for export- LC-MS/MS method 2022-03-14发布 2022-10-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5438—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国广州海关、广州医科大学。 本文件主要起草人：丁博、董洁、李苟、曾广丰、王璐、谢建军、陈文锐。 SN/T5438—2022 出口乳粉中核苷酸含量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本文件规定了游离核苷酸含量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本文件适用于乳粉和调制乳粉中游离核苷酸总量（包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核 苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸5种核苷酸)的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19644一2010食品安全国家标准乳粉 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 乳粉milkpowder 以生羊、牛乳为原料，经加工制成的粉状产品（见GB19644一2010）。 3.2 调制乳粉 formulatedmilkpowder 以生牛（羊）乳或及其加工制品为主要原料，添加其他原料，添加或不添加食品添加剂和营养强化 剂，经加工制成的乳固体含量不低于70%的粉状产品（见GB19644一2010）。 3.3 游离核苷酸 free nucleotide 以核苷酸分子独立形态存在生物体内的物质，包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、 鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸5种核苷酸。 3. 4 蛋白质沉淀 protein precipitation 种样品前处理方法。通过向样品中加入可混溶的有机溶剂致使蛋白质沉淀。 3.5 多反应监测 multiplereactionmonitoring(MRM) 种在串联质谱中使用的定量分析方法，通过在串联质谱仪的第一级（Q1）锁定母离子并在第三级 （Q3）锁定子离子来测定分析物。 1 SN/T 5438—2022 4方法提要 采用水提取试样中的核苷酸，甲酸沉淀蛋白质后，液相色谱-质谱/质谱仪检测和确证，外标法定量。 5试剂和材料 水采用GB/T6682规定的一级水。 5.1乙睛：色谱纯。 5.2甲酸：色谱纯。 5.31%甲酸水溶液：准确吸取10mL甲酸（4.2）,用水定容至1L，混勺。 5.40.1%甲酸水溶液：准确吸取1mL甲酸（4.2）.用水定容至1L，混匀。 5.5标准物质：核苷酸标准品（具体信息参见附录A），纯度均大于99%。 胞嘧啶核苷酸 Cytidine monophosphate(CMP) C,HN,OgP 腺嘌呤核苷酸 Adenosine monophosphate (AMP)CrHμ,N,O,P 尿嘧啶核苷酸 Uridine monophosphate (UMP) C,Hi:N O,P Guanosine monophosphate (GMP) Ch,HN,O,P 鸟嘌呤核苷酸 次黄嘌呤核苷酸 Inosine monophosphate (IMP) CHisNOgP 5.6标准储备液的配制：分别准确称取经纯度折算后的适量标准物质（精确到0.1mg），用水溶解，难 储备溶液。于4℃以下避光保存，有效期6个月。 5.7混合标准溶液的配制：准确吸取标准储备液0.5mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，此标准 溶液浓度为50.0mg/L，于4℃以下冰箱内储存，有效期1个月。 5.8微孔滤膜：0.22μm，有机相型。 6仪器和设备 6.1液相色谱-质谱/质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 6.2超声波水浴。 6.3涡旋混合器。 6.4低温离心机：可制冷至4℃，10000/min。 6.5均质器。 6.6分析天平：感量0.1mg和0.001g。 6.7聚丙烯离心管50mL，具塞。 7测定步骤 7.1提取 称取5.0g均匀样品（精确至0.01g），加30mL水，振荡、超声至完全溶解，转移至100mL容量瓶 中，定容至刻度，取20mL样品溶液转移至50mL容量瓶中，定容至刻度，获得稀释样品溶液；取5mL 稀释试样于50mL容量瓶，加入120μL~150μL1%甲酸溶液（4.3），超纯水定容至刻度线，置于超声 波清洗器中超声波提取10min后（调制乳粉样品不超声直接静止30min，提取核苷酸），在4℃下离心 2 SN/T 5438—2022 20min（转速10000r/min）。吸取上清液，用0.22um滤膜（4.9）过滤，待液相色谱-质谱/质谱仪测定。 7.2混合标准工作溶液的配制 用水将核苷酸混合标准溶液（4.7)分别稀释为0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、 0.4μg/mL0.8μg/mL、1.0μg/mL的系列标准工作液。 7.3测定 7.3.1液相色谱参考条件 7.3.1.1色谱柱 C1g色谱柱，100mmX4.6mm（内径）,3.5μm，或相当者。 7.3.1.2柱温 柱温：40℃。 7. 3. 1. 3 进样量 进样量：10μL。 7. 3. 1. 4 梯度洗脱 流动相、流速及梯度洗脱条件见表1。 反文本为准 表1流动相流速及梯度洗脱条件 时间/ 流速 0.1%甲酸水溶液/% 乙腈/% min (μL/min) 0 500 66 1 3. 5 500 66 1 4. 0 500 10 90 500 10 06 5.5 准信息服务平台 66 1 7. 3. 2 质谱参考条件 7. 3. 2. 1 离子化模式 电喷雾离子源（ESI，ESI模式。 7. 3. 2. 2 扫描方式 多反应监测（MRM)。 7.3.2.3分辨率 单位分辨率。 3