中华人民共和国国家标准 GB4789.42—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验 2016-12-23发布 2017-06-23实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局发布GB4789.42—2016 1 前 言 本标准代替SN/T1635—2005《贝类中诺沃克病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT- PCR方法》。 本标准与SN/T1635—2005相比,主要变化如下: ———标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验”; ———标准检测范围从“贝类”扩增为“食品”; ———修改“操作步骤”; ———增加“质量控制要求”,可参见附录C; ———删除“普通RT-PCR方法”。GB4789.42—2016 2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验 1 范围 本标准规定了食品中诺如病毒(Norovirus)的实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品,草莓、西红柿、葡萄等软质水果等 食品中诺如病毒核酸的检测。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 2.1 实时荧光PCR仪。 2.2 冷冻离心机。 2.3 无菌刀片或等效均质器。 2.4 涡旋仪。 2.5 天平:感量为0.1g。 2.6 振荡器。 2.7 水浴锅。 2.8 离心机。 2.9 高压灭菌锅。 2.10 低温冰箱:-80℃。 2.11 微量移液器。 2.12 pH计或精密pH试纸。 2.13 网状过滤袋:400mL。 2.14 无菌棉拭子。 2.15 无菌贝类剥刀。 2.16 橡胶垫。 2.17 无菌剪刀。 2.18 无菌钳子。 2.19 无菌培养皿。 2.20 无RNase玻璃容器:见E.1.2。 2.21 无RNase离心管、无RNase移液器吸嘴、无RNase药匙、无RNasePCR薄壁管:见E.1.3。 3 试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无RNase超纯水:见E.2.1。 3.1 GⅠ、GⅡ基因型诺如病毒的引物、探针:见A.1。 3.2 过程控制病毒的引物、探针:见A.1。GB4789.42—2016 3 3.3 过程控制病毒:制备见附录C。 3.4 外加扩增控制RNA:制备见附录D。 3.5 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGBE)缓冲液:见E.2.2。 3.6 5×PEG/NaCl溶液(500g/L聚乙二醇PEG8000,1.5mol/LNaCl):见E.2.3。 3.7 磷酸盐缓冲液(PBS):见E.2.4。 3.8 氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5。 3.9 蛋白酶K溶液:见E.2.6。 3.10 75%乙醇:见E.2.7。 3.11 Trizol试剂:见E.2.8。 4 检验程序 诺如病毒检验程序见图1。 图1 诺如病毒检验程序 5 操作步骤 5.1 病毒提取 注:样品处理一般应在4℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将 样品保存在-80℃冰箱中,试验前解冻。样品处理和PCR反应应在单独的工作区域或房间进行。每个样品可 设置2~3个平行处理。 5.1.1 软质水果和生食蔬菜 5.1.1.1 将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm的小块(如水果或蔬菜小于该体 积,可不切)。 5.1.1.2 将样品小块移至带有400mL网状过滤袋的样品袋,加入40mLTGBE溶液(软质水果样品,