书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 １５４００ — ２０１８ /G21 /G22 ＧＢ ／ Ｔ１５４００ — １９９４ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋狉狔狆狋狅狆犺犪狀犻狀犳犲犲犱狊 ２０１８  ０９  １７ /G2A /G2B ２０１９  ０４  ０１ /G2C /G2D /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2A /G2B书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１５４００ — １９９４ 《 饲料中色氨酸的测定 　 分光光度法 》。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ１５４００ — １９９４ 相比 ， 除编辑性修改外 ， 主要技术内容的变化 ： ——— 增加了高效液相色谱法 ， 修改了适用对象 ， 增加了两个方法的定量限 （ 见第 １ 章 ， １９９４ 年版的第 １ 章 ）。 ——— 修改了分光光度法原理的表述 （ 见 ４．１ ， １９９４ 年版的第 ３ 章 ）。 ——— 修改了精密度的表述 （ 见 ４．７ ， １９９４ 年版的 ８．３ ）。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ７６ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 ［ 国家饲料质量监督检验中心 （ 北京 ）］、 通威股份有限公司 。 本标准主要起草人 ： 李兰 、 贾铮 、 赵艳 、 赵根龙 、 宋军 、 张凤枰 。 本标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１５４００ — １９９４ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １５４００ — ２０１８ 饲料中色氨酸的测定 １ 　 范围 本标准规定了饲料中色氨酸含量测定的高效液相色谱法和分光光度法 。 本标准适用于饲料原料 、 配合饲料 、 浓缩饲料和精料补充料中色氨酸的测定 。 高效液相色谱法的定量限为 ０．０２％ ； 当试样最大称样量为 ７００ｍｇ ， 水解液稀释倍数为 ２５ 倍时 ， 分光光度法的定量限为 ０．０４％ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６４３３ 　 饲料中粗脂肪的测定 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料试样的制备 ３ 　 高效液相色谱法 （ 仲裁法 ） ３ ． １ 　 原理 试样中的色氨酸经氢氧化锂溶液水解 ， 用高效液相色谱法分离 ， 紫外或荧光检测器检测 ， 外标法定量 。 ３ ． ２ 　 试剂或材料 除特殊注明外 ， 本标准所用试剂均为分析纯 。 ３ ． ２ ． １ 　 水 ： 符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水的规定 。 ３ ． ２ ． ２ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ３ ． ２ ． ３ 　 氢氧化钾溶液 （ ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ０．５６ｇ 氢氧化钾 ， 溶解于 １００ｍＬ 水中 ， 即得 。 ３ ． ２ ． ４ 　 氢氧化锂溶液 （ ４ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ８３．９ｇ 氢氧化锂 ， 溶解于 ５００ｍＬ 水中 ， 即得 。 ３ ． ２ ． ５ 　 乙酸钠缓冲溶液 （ ０．００８５ｍｏｌ ／ ＬＮａ ＋ ， ｐＨ＝４．５ ）： 称取 ０．７０ｇ 无水乙酸钠 ， 溶解于 １０００ｍＬ 水中 ， 用冰乙酸调节 ｐＨ 为 ４．５ 。 ３ ． ２ ． ６ 　 流动相 ： 乙酸钠缓冲溶液 （ ３．２．５ ） ＋ 甲醇 （ ３．２．２ ） ＝９５＋５ 。 ３ ． ２ ． ７ 　 Ｌ 色氨酸标准储备溶液 ： 准确称取 ２５ｍｇ （ 精确到 ０．０００１ｇ ） 色氨酸对照品 （ 纯度大于 ９９％ ）， 置于 ２５ｍＬ 烧杯中 ， 用滴管滴加氢氧化钾溶液 （ ３．２．３ ） 使其溶解 ， 将其定量地转移至 ２５０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用水定容 ， 浓度为 １００ μ ｇ ／ ｍＬ 。 ２℃ ～ ８℃ 保存 ， 有效期为 １ 个月 。 ３ ． ２ ． ８ 　 Ｌ 色氨酸标准系列溶液 ： 准确移取 Ｌ 色氨酸标准储备溶液 （ ３．２．７ ） ５．００ｍＬ 、 ７．５０ｍＬ 、 １０．００ｍＬ 、 １２．５０ｍＬ 、 １５．００ｍＬ 、 １７．５０ｍＬ 分别置于 ２５ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用水定容至刻度 ， 摇匀 。 其溶液浓度分别为 ２０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ３０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ４０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ６０ μ ｇ ／ ｍＬ 和 ７０ μ ｇ ／ ｍＬ 。 ２℃ ～ ８℃ 保存 ， 有效期为 ２ 周 。 １ 犌犅 ／ 犜 １５４００ — ２０１８ ３ ． ３ 　 仪器设备 ３ ． ３ ． １ 　 天平 ： 感量 ０．０００１ｇ 、 感量 ０．００１ｇ 。 ３ ． ３ ． ２ 　 聚四氟乙烯水解管 ： 配衬管和密封垫 。 ３ ． ３ ． ３ 　 恒温干燥箱 ： 可达到 １１０℃±２℃ 。 ３ ． ３ ． ４ 　 离心机 ： 转速不低于 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ３ ． ３ ． ５ 　 高效液相色谱仪 ： 配紫外检测器或者荧光检测器 。 ３ ． ４ 　 样品 按 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 的规定 ， 抽取有代表性的饲料样品 ， 用四分法缩减取样 。 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 制备试样 ， 磨碎 ， 全部通过 ０．２５ｍｍ 孔筛 ， 混匀 ， 装入密闭容器中 ， 备用 。 取适量试样 ， 按照 ＧＢ ／ Ｔ６４３３ 测定试样脂肪含量 。 ３ ． ５ 　 试验步骤 ３ ． ５ ． １ 　 脂肪含量小于 ４ ％ 的试样 平行做两份试验 。 称取未脱脂试样 ５０ｍｇ ～ １００ｍｇ （ 精确至 ０．０００１ｇ ）， 置于聚四氟乙烯水解管 （ ３．３．２ ） 衬管中 ， 加 １．５ｍＬ 氢氧化锂溶液 （ ３．２．４ ）， 充氮 １ｍｉｎ ， 旋紧密封盖后放入 １１０℃±２℃ 恒温干燥箱 （ ３．３．３ ） 中 ， 水解 ２０ｈ 。 取出水解管 ， 冷却至室温 ， 用乙酸钠缓冲溶液 （ ３．２．５ ） 将水解液定量地转移至 ２５ｍＬ 容量瓶中 ， 并用上述缓冲溶液定容 ， 离心或者过 ０．４５ μ ｍ 滤膜后上液相色谱仪测定 。 ３ ． ５ ． ２ 　 脂肪含量大于 ４ ％ 的试样 称取脱脂后的试样 ， 按照 ３．５．１ 步骤进行水解 。 ３ ． ５ ． ３ 　 参考色谱条件 色谱柱 ： Ｃ １８ ， 长 ２５０ｍｍ ， 内径 ４．６ｍｍ ， 粒度 ５ μ ｍ ， 或性能相当者 。 流动相 ： 见 ３．２．６ 。 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 柱温 ： 室温 。 进样体积 ： １０ μ Ｌ ～ ２０ μ Ｌ 。 检测器 ： 紫外或二极管矩阵检测器 ， 检测波长 ２８０ｎｍ 。 荧光检测器 ， 激发波长 ： ２８３ｎｍ ； 发射波长 ： ３４３ｎｍ 。 ３ ． ５ ． ４ 　 测定 按上述规定的色谱条件平衡色谱柱 ， 向色谱柱注入相应的色氨酸标准系列溶液 （ ３．２．８ ） 和试样溶液 （ ３．５．１ 或 ３．５．２ ）， 以保留时间定性 ； 在线性范围内 ， 用外标法单点校正定量 。 色氨酸标准溶液色谱图参见附录 Ａ 中图 Ａ．１ 。 ３ ． ６ 　 试验数据处理 ３ ． ６ ． １ 　 未脱脂试样中的色氨酸含量以质量分数 狑 １ 计 ， 数值以克每 １００ 克表示 ， 按式 （ １ ） 计算 ： 狑 １ ＝ 犃 犻 × 犞 × ρ × 犞 ｓｔ 犃 ｓｔ × 犿 × 犞 犻 × １０ － ４ ……………………（ １ ） 　　 ２ 犌犅 ／ 犜 １５４００ — ２０１８ 式中 ： 犃 犻 　 ——— 试样溶液峰面积值 ； 犞 ——— 试样稀释体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； ρ ——— 色氨酸对照品溶液的质量浓度 ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ｓｔ ——— 色氨酸对照品溶液进样体积 ， 单位为微升 （ μ Ｌ ）； 犃 ｓｔ ——— 色氨酸对照品溶液峰面积平均值 ； 犿 ——— 试样质量 ， 单位为克 （ ｇ ）； 犞 犻 ——— 试样溶液进样体积 ， 单位为微升 （ μ Ｌ ）。 ３ ． ６ ． ２ 　 脱脂试样中的色氨酸含量以质量分数 狑 ２ 计 ， 数值以克每 １００ 克表示 ， 按式 （ ２ ） 计算 ： 狑 ２ ＝ 犃 犻 × 犞 × 犮 × 犞 ｓｔ 犃 ｓｔ × 犿 × 犞 犻 × （ １ － 犉 ） × １０ － ４ ……………………（ ２ ） 　　 式中 ： 犉 ——— 脂肪含量 ， ％ 。 式中其他参数同式 （ １ ） 解释 。 测定结果用平行测定的算术平均值表示 ， 保留两位小数 。 ３ ． ７ 　 精密度 在重复性条件下 ， 当试样中色氨酸含量小于 ０．１％ 时 ， 两次独立测定结果的绝对差值应不大于 ０．０１％ 。 当试样中色氨酸含量在 ０．１％ ～ ０．５％ 时 ， 两次独立测定结果与其