书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ６ — ２００８ 部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．１ — １９９５ 鱼类检疫方法 第 ６ 部分 ： 杀鲑气单胞菌 犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犿犲狋犺狅犱狊狅犳犳犻狊犺 — 犘犪狉狋 ６ ： 犃犲狉狅犿狅狀犪狊狊犪犾犿狅狀犻犮犻犱犪 ２００８  ０７  ３１ 发布 ２００８  １１  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５ 《 鱼类检疫方法 》 分为下列部分 ： ——— 第 １ 部分 ： 传染性胰脏坏死病毒 （ ＩＰＮＶ ）； ——— 第 ２ 部分 ： 传染性造血器官坏死病毒 （ ＩＨＮＶ ）； ——— 第 ３ 部分 ： 病毒性出血性败血症病毒 （ ＶＨＳＶ ）； ——— 第 ４ 部分 ： 斑点叉尾 /G21 病毒 （ ＣＣＶ ）； ——— 第 ５ 部分 ： 鲤春病毒血症病毒 （ ＳＶＣＶ ）； ——— 第 ６ 部分 ： 杀鲑气单胞菌 ； ——— 第 ７ 部分 ： 脑粘体虫 ； …… 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５ 的第 ６ 部分 。 本部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．１ — １９９５ 《 淡水鱼类检疫方法 　 第一部分 》 中的第 ８ 章 。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．１ — １９９５ 的第 ８ 章相比主要变化如下 ： ——— 删去临床检查 ； ——— 用国际通用的 ＡＰＩ 鉴定系统来判断杀鲑气单胞菌 ， 代替原来简单用几个生化鉴定结果来判定 的方法 ； ——— 增加附录 “ 杀鲑气单胞菌各亚种的生化特性表 ”； ——— 结构格式按 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０００ 的规定 ， 作为部分编写 。 本部分的附录 Ａ 为规范性附录 。 本部分由中华人民共和国农业部提出 。 本部分由全国水产标准化技术委员会归口 。 本部分起草单位 ： 农业部全国水产技术推广总站 、 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 。 本部分主要起草人 ： 孙喜模 、 江育林 、 陈爱平 、 陈辉 、 朱泽闻 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．１ — １９９５ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ６ — ２００８ 鱼类检疫方法 第 ６ 部分 ： 杀鲑气单胞菌 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５ 的本部分规定了用细菌分离和生化鉴定的方法检测疖疮病病原 ——— 杀鲑气单胞菌的 方法 。 本部分适用于杀鲑气单胞菌的分离及鉴定 ， 疖疮病的流行病学调查 、 诊断 、 监测 ， 以及口岸出入境 、 国内跨区域移动的鱼类检疫 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５ 的本部分的引用而成为本部分的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本部分 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成协议的 各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本部分 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ — ２０００ 　 出入境动物检疫采样 ３ 　 试剂和材料 ３ ． １ 　 水 ： ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， 二级 。 ３ ． ２ 　 杀鲑气单胞菌参考菌株 ： 由农业部指定的动物病原微生物菌 （ 毒 ） 种保藏机构提供 。 ３ ． ３ 　 ＡＰＩ２０ＮＥ 试剂条 ： ４℃ 保存 。 按照说明书指示的方法使用 。 ３ ． ４ 　 革兰氏染色液 ： 按说明书指示的方法使用 。 ３ ． ５ 　 ＴＳＡ 培养基 ： 按说明书指示的方法配制 。 ３ ． ６ 　 氧化酶试纸 ： 按说明书指示的方法使用 。 ４ 　 器材和设备 ４ ． １ 　 恒温培养箱 。 ４ ． ２ 　 离心机和离心管 。 ４ ． ３ 　 显微镜 （ 具油镜 、 暗视野 ）、 载玻片 、 盖玻片 。 ４ ． ４ 　 普通冰箱和低温冰箱 。 ４ ． ５ 　 剪刀 、 镊子 、 接种环 、 培养皿等 。 ５ 　 杀鲑气单胞菌的分离 ５ ． １ 　 取样 按 ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ — ２０００ 规定执行 。 如果鱼体有红肿渍疡 ， 用解剖刀切开患部 （ 或溃疡部 ）， 将干净的 载玻片贴紧病灶并挤压 ， 加 １ 滴 ～ ２ 滴生理盐水后盖上盖玻片 ， ４００ 倍 ～ ６００ 倍镜检菌体形态和运动状 态 ， 并做革兰氏染色 。 若鱼体表无任何症状 ， 则需从肾中分离细菌 。 ５ ． ２ 　 选择性培养基分离 将样品接种到 ＴＳＡ 培养基 ， ２５℃ 培养 ７２ｈ 。 ＴＳＡ 上会生长白色的菌落 （ 注意 ： 有的亚种会产生水 １ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ６ — ２００８ 溶性褐色素如杀鲑亚种 ， 而其他亚种没有色素产生 ）。 如果在 ＴＳＡ 平板中加入 １００ｍｇ ／ Ｌ 的考马斯亮 兰 ， 则生长的菌落为深蓝色 。 ５ ． ３ 　 细菌鉴定 ５ ． ３ ． １ 　 革兰氏染色和形态观察 革兰氏染色后 ， 菌体呈红色表示革兰氏阴性 ； 菌体呈紫色表示革兰氏阳性 。 该菌应为革兰氏阴性 菌 ， 短杆状 。 ５ ． ３ ． ２ 　 运动性观察 取干净的载玻片 ， 滴 １ 滴 ～ ２ 滴生理盐水 。 用接种环从斜面上挑培养 １２ｈ ～ ２４ｈ 的菌落涂抹在水 滴中 ， 盖上盖玻片 。 ４００ 倍 ～ ６００ 倍镜检菌体形态和运动状态 。 细菌能快速运动或产生位移的 ， 为有运 动性 ； 细菌在原地来回颤动的 （ 即布朗运动 ）， 为没有运动性 。 该菌应不运动 。 ５ ． ３ ． ３ 　 氧化酶试验 用接种白金耳环挑取少量菌苔涂于氧化酶试纸上 ， ５ｓ 内观察结果 。 菌苔呈红色或紫色表示氧化酶 试验阳性 ， 不变色表示氧化酶试验阴性 。 该菌应为氧化酶阳性 。 ５ ． ３ ． ４ 　 生化鉴定 如果革兰氏染色阴性 ， 氧化酶阳性 ， 不运动 ， 则进一步用 ＡＰＩ２０ＮＥ 试剂条测定 。 方法 ： 将培养 ２４ｈ 的纯化的细菌按要求稀释后接种到试剂条的每个孔内 ， 然后置于 ２５℃ 培养 ４８ｈ ～ ７２ｈ ， 取出来检查反应是阳性还是阴性 ， 把结果输入随 ＡＰＩ 试剂条所附的数据库 ， 阳性值输入 “ ＋ ” 号 ， 阴性值输入 “ － ” 号 。 如果是杀鲑气单胞菌 ， 还能指出是什么亚种如杀鲑亚种 ， 或者是无色亚种 还是史氏亚种 ， 并指出是不是 “ 极好的鉴定结果 ， 没有不符合项 ”， 还是 “ 不确定的结果 ” 或者几率很低 。 后二者可能是送检的细菌不纯 ， 无法判定所致 。 需要重新纯化细菌再做 。 如果是其他细菌 ， 该试剂条也 能明确判定是什么细菌 。 金鱼亚种由于是非典型种 ， 不能用 ＡＰＩ２０ＮＥ 检出 。 需要和附录 Ａ 的生化特性对照 。 ６ 　 综合判定 凡检出杀鲑气单胞菌者 ， 不论是从鱼体红肿 、 隆起 、 局部软化 、 组织坏死等处分离到 ， 还是鱼外观正 常但可从肾中分离到 ， 即可判定为阳性 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ６ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 规范性附录 ） 杀鲑气单胞菌各亚种的生化特性表 表 犃 ． １ 　 杀鲑气单胞菌各亚种的生化特性表 特 　　 性 无色亚种 日本鲑亚种 杀鲑亚种 史氏亚种金鱼亚种 （ 非典型种 ） 产生吲哚 ＋ ＋ － － ＋ 甲基红试验 （ Ｍ．Ｒ ） ＋ ＋ ＋ － ＶＰ 反应 － ＋ － － － 柠檬酸盐 － － － － ＋ ／ － 硫化氢 （ Ｈ ２ Ｓ 产生 ） － ＋ － ＋ － 水解尿素 － － － － － 苯丙氨酸脱氢酶 － － － － － 精氨酸双水解酶 ＋ ＋ ＋ （ － ） － 鸟氨酸脱羧酶 － － － － － 运动性 － － － － － 明胶水解 ＋ ＋ ＋ ＋ － 氰化钾 （ ＫＣＮ ） 生长 － － － ？ ？ 丙二酸利用 － － － ？ ？ Ｄ 葡萄糖产酸 ＋ ＋ ＋ （ ＋ ） ＋ Ｄ 葡萄糖产气 － ＋ ＋ （ ＋ ） ＋ 产酸阿东醇 － － － ？ － 阿拉伯糖 － ＋ ＋ ？ － 阿拉伯醇 － － － ？ ？ 纤维二糖 － － － － ？ 卫矛醇 － － － ？ － 赤藓醇 － － － ？ ？ 半乳糖 ＋ ＋ ＋ － ？ 甘油 ｄ Ｄ ｄ （ － ） ＋ 间  肌醇 － － － － ？ 乳糖 － － － － － 麦芽糖 ＋ ＋ ＋ － ＋ Ｄ 甘露醇 － ＋ ＋ － ＋ Ｄ 甘露糖 ＋ ＋ ＋ ？ ？ 棉籽糖 － － － － － Ｌ 鼠李糖 － － － ？ － Ｄ 山梨醇 － － － （ － ） － 海藻糖 ＋ ＋ ＋ － － Ｄ 木糖 － － － － － 黏液酸 － － － － － 七叶灵水解 － ＋ ＋ － － 酒石酸 － － － ？ ？ 脂酶 （ 玉米油 ） ＋ ＋ ＋ － ？ ＤＮａｓｅ ＋ ＋ ＋ ＋ ？ 硝酸盐还原 ＋ ＋ ＋ ？ ＋ 氧化酶 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＯＮＰＧ ｄ Ｄ ｄ ＋ ？ 柠檬酸 － － － ？ ？ 棕色可溶性色素 － － ＋ － － 犌犅 ／ 犜 １５８０５ ． ６ — ２００８ 书 书 书 ８００２ — ６  ５０８５１ 犜 ／ 犅犌 中华人民共和国 国家标准 鱼类检疫方法 第 ６ 部分 ： 杀鲑气单胞菌 ＧＢ ／ Ｔ１５８０５．６ — ２００８  中国标准出版社出版发行 北京复兴