书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ２ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．１ — １９９９ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ２ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 红细胞凝集抑制试验 犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 — 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊狌狉狏犲犻犾犾犪狀犮犲 — 犘犪狉狋 ２ ： 犎犲犿犪犵犵犾狌狋犻狀犪狋犻狅狀犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀狋犲狊狋犳狅狉犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 　　 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测 》 分为 １０ 个部分 ： ——— 第 １ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测总则 ； ——— 第 ２ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 红细胞凝集抑制试验 ； ——— 第 ３ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清中和试验 ； ——— 第 ４ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清平板凝集试验 ； ——— 第 ５ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 琼脂扩散试验 ； ——— 第 ６ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 酶联免疫吸附试验 ； ——— 第 ７ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 胚敏感试验 ； ——— 第 ８ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 鸡白痢沙门氏菌检验 ； ——— 第 ９ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 试管凝集试验 ； ——— 第 １０ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 间接免疫荧光试验 。 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的第 ２ 部分 。 本部分修订参照了 ＧＢ ／ Ｔ１８９３６ — ２００３ 《 高致病性禽流感诊断技术 》、 ＳＮ ／ Ｔ１１０９ — ２００２ 《 新城疫微 量红细胞凝集抑制 　 试验操作规程 》、 ＳＮ ／ Ｔ１１８２．２ — ２００４ 《 禽流感微量红细胞凝集抑制试验 》、 ＮＹ ／ Ｔ５５１ — ２００２ 《 产蛋下降综合征诊断技术 》、 ＯＩＥ 《 陆生动物 （ 哺乳动物 、 禽鸟和蜜蜂 ） 诊断试验和疫苗 手册 》（ 第五版 ） 中的有关规定 。 本部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．１ — １９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 红细胞凝集抑制试验 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．１ — １９９９ 相比主要变化如下 ： ——— 增加了规范性附录 Ａ “ 试剂的配制 ” 和资料性附录 Ｂ “ １％ 鸡血红细胞悬液的制备 ”； ——— 增加了对 Ｖ 形孔微量血凝板进行试验的结果判定 ； ——— 对禽流感病毒 、 新城疫病毒 、 传染性支气管炎病毒 、 禽腺病毒 Ⅲ 群 （ ＥＤＳ ） 鸡毒支原体和滑液囊 支原血凝抑制抗体的判定标准进行了修改 。 本部分的附录 Ａ 为规范性附录 ， 附录 Ｂ 为资料性附录 。 本部分由中华人民共和国农业部提出 。 本部分由全国动物防疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本部分起草单位 ： 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 、 中国动物卫生与流行病学中心 、 济南斯帕法 斯家禽有限公司 。 本部分主要起草人 ： 曲连东 、 刘家森 、 韩凌霞 、 邵卫星 、 朱果 、 单忠芳 、 姜骞 、 司昌德 、 于海波 、 孟庆文 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．１ — １９９９ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ２ — ２００８ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ２ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 红细胞凝集抑制试验 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的本部分规定了红细胞凝集抑制试验的技术要求 。 本部分适用于对 ＳＰＦ 鸡进行以下病原微生物的血凝抑制抗体检测 ： 禽流感病毒 （ ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ ）， 传染性支气管炎病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＢｒｏｎｃｈｉｔｉｓＶｉｒｕｓ ）， 新城疫病毒 （ ＮｅｗｃａｓｔｌｅＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ）， 禽 腺病毒 Ⅲ 群 （ 减蛋综合征病毒 ）（ ＡｖｉａｎＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＧｒｏｕｐ Ⅲ ）， 鸡毒支原体 （ 犕狔犮狅狆犾犪狊犿犪犵犪犾犾犻狊犲狆狋犻犮 狌犿 ）， 滑液囊支原体 （ 犕狔犮狅狆犾犪狊犿犪狊狔狀狅狏犻犪犲 ）。 ２ 　 原理 许多病原微生物具有凝集动物红细胞的能力 ， 这种凝集红细胞的能力能被特异性抗体所抑制 ， 因此 可用已知病原微生物检测相应的血凝抑制性抗体 。 ３ 　 试剂和器材 ３ ． １ 　 试剂 ３ ． １ ． １ 　 血凝抗原 。 ３ ． １ ． ２ 　 阴性 、 阳性血清 。 ３ ． １ ． ３ 　 被检血清 。 ３ ． １ ． ４ 　 鸡红细胞 。 ３ ． １ ． ５ 　 ０．８５％ 氯化钠 （ ＮａＣｌ ）（ 见附录 Ａ ）。 ３ ． １ ． ６ 　 阿氏液 （ 见附录 Ａ ）。 ３ ． ２ 　 器材 ３ ． ２ ． １ 　 ９６ 孔微量血凝板 （ Ｕ 形孔或 Ｖ 形孔 ）。 ３ ． ２ ． ２ 　 微量移液器 （ 量程为 ２５ μ Ｌ 、 ５０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ） 或可调微量移液器 （ 量程涵盖 ２５ μ Ｌ 、 ５０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ） 及吸头 。 ３ ． ２ ． ３ 　 水浴锅 。 ３ ． ２ ． ４ 　 离心机与刻度离心管 。 ４ 　 操作程序 ４ ． １ 　 红细胞悬液的制备和抗原血凝效价测定 ４ ． １ ． １ 　 １ ％ 鸡红细胞悬液的制备 参见附录 Ｂ 。 ４ ． １ ． ２ 　 抗原血凝效价测定 ４ ． １ ． ２ ． １ 　 于 ９６ 孔微量血凝板的第 １ 孔 ～ 第 １２ 孔加入生理盐水 ２５ μ Ｌ ， 共作 ２ 排 。 每排的第 １ 孔加入 抗原 ２５ μ Ｌ ， 用微量移液器 ， 从第 １ 孔 ～ 第 １１ 孔对抗原作系列倍比稀释 ： 即将第 １ 孔的抗原与生理盐水 用移液器反复吹吸 ３ 次后 ， 吸出 ２５ μ Ｌ 移至第 ２ 孔 ， 再反复吹吸 ３ 次后 ， 吸出 ２５ μ Ｌ 移至第 ３ 孔 ， 依此类 推 ， 直至第 １１ 孔 。 从第 １１ 孔中吸出 ２５ μ Ｌ 弃去 ， 此孔抗原的最终稀释度为 １∶２ １１ （ 即 １１ｌｏｇ ２ ）。 第 １２ 孔作为对照孔 。 １ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ２ — ２００８ ４ ． １ ． ２ ． ２ 　 每孔中加入 ２５ μ Ｌ 生理盐水 ， 再加入 １％ 鸡红细胞悬液 ２５ μ Ｌ 。 ４ ． １ ． ２ ． ３ 　 将血凝板置振荡器上 ５００ｒ ／ ｍｉｎ 振荡 １ｍｉｎ ～ ２ｍｉｎ 。 ４ ． １ ． ２ ． ４ 　 在室温 １８℃ ～ ２５℃ 下静置 ２０ｍｉｎ ～ ４０ｍｉｎ ， 或 ３７℃ 静置 １５ｍｉｎ ～ ２０ｍｉｎ ， 或 ４℃ 静置 ６０ｍｉｎ 。 ４ ． １ ． ２ ． ５ 　 抗原血凝效价判定 ： 在反应时间内 ， 对照孔的红细胞全部沉淀时 ， 观察判读血凝结果 。 对于使用 Ｕ 形孔微量血凝板进行的试验 ， 可根据表 １ 中列举的标准进行判读 。 表 １ 　 血凝试验结果判读标准 类 　　 别 孔 　 底 　 所 　 见 结 　　 果 １ 红细胞全部凝集 ， 均匀铺于孔底 ， 即 １００％ 红细胞凝集 ＋＋＋＋ ２ 红细胞凝集基本同类别 １ ， 但孔底有大圈 ＋＋＋ ３ 红细胞于孔底形成中等大的圈 ， 四周有小凝块 ＋＋ ４ 红细胞于孔底形成小圆点 ， 四周有少许凝集块 ＋ ５ 红细胞于孔底呈小圆点 ， 边缘光滑整齐 ， 即红细胞完全不凝集 － 　　 注 ： 能使红细胞完全凝集 （ １００％ 凝集 ， ＋＋＋＋ ） 的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价 ， 此效价为 １ 个血凝单 位 。 注意对照孔应呈现完全不凝集 （ － ）， 否则此次试验无效 。 　　 对于使用 Ｖ 形孔微量血凝板进行的试验 ， 将血凝板倾斜 ７０° ， 观察沉淀于孔底的红细胞是否沿倾斜 面向下呈线状流动 。 以出现全部凝集 （ 红细胞无流动 ） 的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价 ， 该效价 为 １ 个血凝单位 。 若血凝效价高于 １１ｌｏｇ ２ 时 ， 可继续增加稀释孔数 ， 进行血凝效价测定 。 血凝试验举例说明见表 ２ 。 表 ２ 　 微量血凝试验操作 、 结果判定举例 　　 血凝价判定为 ９ｌｏｇ ２ 。 ４ ． ２ 　 血清的处理和血凝抑制试验 ４ ． ２ ． １ 　 被检血清样品准备 被检血清 ， 包括阳性 、 阴性血清 ， 置于 ５６℃ 水浴中 ３０ｍｉｎ ～ ４５ｍｉｎ ， 以破坏补体及血凝抑制因子 。 ４ ． ２ ． ２ 　 抗原准备 进行血凝抑制试验时各种抗原所用血凝单位为 ４ 个血凝单位 。 以 ４ 个血凝单位抗原的配制为例 ： 如果某抗原的血凝效价为 ９ｌｏｇ ２ ， 配制 ４ 个血凝单位则进行 １∶２ ７ 稀释 （ ２ ９ ／ ２ ２ ＝２ ７ ）， 取生理盐水 １１．８ｍＬ ， 加入 １∶１０ 稀释的抗原 １．０ｍＬ ， 混合均匀即可 。 ４ ． ２ ． ３ 　 抗原血凝效价的重测定 ４ ． ２ ． ３ ． １ 　 为了确证血凝抑制试验时使用抗原的活性 ， 有必要对已配制的 ４ 个血凝单位抗原进行血凝效 ２ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ２ — ２００８ 价的再测定 ， 此项试验常与血凝抑制试验同时进行 。 ４ ． ２ ． ３ ． ２ 　 第 １ 孔分别加入 ５０ μ Ｌ４ 个血凝单位抗原 。 ４ ． ２ ． ３ ． ３ 　 第 ２ 孔 ～ 第 ４ 孔各加生理盐水