书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ５ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．４ — １９９９ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ５ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 琼脂扩散试验 犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 — 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊狌狉狏犲犻犾犾犪狀犮犲 — 犘犪狉狋 ５ ： 犃犵犪狉犵犲犾狆狉犲犮犻狆犻狋犪狋犻狅狀狋犲狊狋犳狅狉犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测 》 分为 １０ 个部分 ： ——— 第 １ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测总则 ； ——— 第 ２ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 红细胞凝集抑制试验 ； ——— 第 ３ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清中和试验 ； ——— 第 ４ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清平板凝集试验 ； ——— 第 ５ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 琼脂扩散试验 ； ——— 第 ６ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 酶联免疫吸附试验 ； ——— 第 ７ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 胚敏感试验 ； ——— 第 ８ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 鸡白痢沙门氏菌检验 ； ——— 第 ９ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 试管凝集试验 ； ——— 第 １０ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 间接免疫荧光试验 。 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的第 ５ 部分 。 本部分修订参照了 ＧＢ ／ Ｔ１８９３６ — ２００３ 《 高致病性禽流感诊断技术 》、 ＮＹ ／ Ｔ５４０ — ２００２ 《 鸡病毒性 关节炎琼脂凝胶免疫扩散试验方法 》、 ＮＹ ／ Ｔ５５６ — ２００２ 《 鸡传染性喉气管炎诊断技术 》、 ＯＩＥ 《 陆生动物 （ 哺乳动物 、 禽鸟和蜜蜂 ） 诊断试验和疫苗手册 》（ 第五版 ） 中的有关规定 。 本部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．４ — １９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 琼脂扩散试验 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．４ — １９９９ 相比主要变化如下 ： ——— 增加了加样示意图 、 结果判定示意图以示说明 ； ——— 增加了附录 Ａ “ 马立克氏病病毒抗原琼脂扩散检验的程序 ”； ——— 增加了附录 Ｂ “ 试剂的配制 ”。 本部分的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 为规范性附录 。 本部分由中华人民共和国农业部提出 。 本部分由全国动物防疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本部分起草单位 ： 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 、 中国动物卫生与流行病学中心 、 济南斯帕法 斯家禽有限公司 。 本部分主要起草人 ： 曲连东 、 姜骞 、 韩凌霞 、 邵卫星 、 朱果 、 单忠芳 、 刘家森 、 司昌德 、 郭东春 、 于海波 、 孟庆文 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．４ — １９９９ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ５ — ２００８ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ５ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 琼脂扩散试验 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的本部分规定了琼脂扩散试验的技术要求 。 本部分适用于对 ＳＰＦ 鸡进行以下病原微生物的血清抗体检测 ： 禽流感病毒 （ ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｚａ Ｖｉｒｕｓ ）、 传染性支气管炎病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＢｒｏｎｃｈｉｔｉｓＶｉｒｕｓ ）、 传染性法氏囊病病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＢｕｒｓａ ＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ）、 传染性喉气管炎病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＬａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓＶｉｒｕｓ ）、 禽痘病毒 （ ＦｏｗｌＰｏｘ Ｖｉｒｕｓ ）、 禽脑脊髓炎病毒 （ ＡｖｉａｎＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓＶｉｒｕｓ ）、 网状内皮增生症病毒 （ Ｒｅｔｉｅｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ ）、 禽呼肠孤病毒 （ 病毒性关节炎 ）（ ＡｖｉａｎＲｅｏｖｉｒｕｓ ）、 马立克氏病病毒 （ Ｍａｒｅｋ ’ ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ）、 禽 腺病毒 Ⅰ 群 （ ＡｖｉａｎＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＧｒｏｕｐ Ⅰ ）、 多杀性巴氏杆菌 （ 犘犪狊狋犲狌狉犲犾犾犪犿狌犾狋狅犮犻犱犪 ）。 本部分同样适用 于对 ＳＰＦ 鸡进行马立克氏病病毒 （ Ｍａｒｅｋ ’ ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ） 抗原的检测 （ 见附录 Ａ ）。 ２ 　 原理 抗原 、 抗体在含有电解质的琼脂凝胶中 ， 可以向四周自由扩散 ， 二者互相结合 ， 在最适比例处出现沉 淀线 。 采用已知抗原检测相应的抗体 ， 或已知抗体鉴定相应的抗原 。 ３ 　 试剂和材料 ３ ． １ 　 试剂 ３ ． １ ． １ 　 琼扩抗原或抗体 。 ３ ． １ ． ２ 　 标准阳性血清 。 ３ ． １ ． ３ 　 被检血清或羽髓 。 ３ ． １ ． ４ 　 ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ 、 ｐＨ７．２ 的 ８％ 氯化钠磷酸盐缓冲溶液 （ 见附录 Ｂ ）。 ３ ． １ ． ５ 　 ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ 、 ｐＨ６．４ 的 ８％ 氯化钠磷酸盐缓冲溶液 （ 检测禽流感病毒抗体时使用 ， 见附录 Ｂ ）。 ３ ． １ ． ６ 　 优质琼脂粉或琼脂糖 。 ３ ． ２ 　 材料 琼扩板 ， 打孔器 ， 移液器 。 ４ 　 操作程序 ４ ． １ 　 琼脂板制备 将 １ｇ 优质琼脂粉或 ０．８ｇ ～ １．０ｇ 琼脂糖加入 １００ｍＬ 的 ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ 、 ｐＨ７．２ 的 ８％ 氯化钠磷酸缓 冲液中 （ 检测禽流感病毒抗体时使用 ）， 水浴加热融化 ， 稍凉 （ ６０℃ ～ ６５℃ ）， 倒入琼扩板内 （ 厚度为 ３ｍｍ ）， 待琼脂凝固后 ， ４℃ 冰箱保存备用 。 ４ ． ２ 　 打孔 用打孔器在琼脂板上按 ７ 孔梅花图案打孔 ， 孔径 ３ｍｍ ～ ４ｍｍ ， 孔距 ３ｍｍ 。 用 ８ 号针头挑出孔内 琼脂 ， 挑出时从孔一侧边缘插入针头 ， 轻轻移动 ， 等空气进入孔底后 ， 再向上挑出 。 ４ ． ３ 　 封底 用酒精灯轻烤平皿底部至微融化 ， 以防侧漏 。 ４ ． ４ 　 加样 用移液器吸取抗原悬液 ， 滴入中间孔 （ 图 １ 中的 ⑦ 号孔 ）， 周围 ① 、 ④ 号孔加阳性血清 ， 其余孔加被检 １ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ５ — ２００８ 血清 ， 每孔均以不溢出为度 ， 每加一个样品应换一个枪头 。 图 １ 　 琼脂扩散结果 ４ ． ５ 　 感作 将琼扩板加盖保湿 ， 放于 ３７℃ 温箱内作用 ２４ｈ ～ ７２ｈ ， 观察沉淀线 。 ５ 　 结果判定 ５ ． １ 　 判定方法 将琼脂板置于日光灯或侧强光下观察 ， 若标准阳性血清 （ 图 １ 中的 ① 和 ④ 号孔 ） 与抗原孔之间出现 一条清晰的白色沉淀线 ， 则试验成立 。 ５ ． ２ 　 判定标准 ５ ． ２ ． １ 　 阳性结果 ： 被检血清孔与中心抗原孔之间出现清晰的沉淀线 ， 且该线和抗原与标准阳性血清之 间沉淀线的末端相吻合 。 ５ ． ２ ． ２ 　 弱阳性结果 ： 被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线 ， 标准阳性血清 （ 如图 １ 中 ④ 号孔 ） 的沉淀 线一端向被检血清孔内侧弯曲 ， 则此孔的被检样品判为弱阳性 （ 凡弱阳性者应重复试验 ， 仍为弱阳性者 ， 判为阳性 ）。 ５ ． ２ ． ３ 　 阴性结果 ： 被检血清 （ 如图 １ 中的 ⑤ 号孔 ） 孔与中心孔之间不出现沉淀线 ， 且标准阳性血清沉淀 线直向被检血清孔 ， 则被检血清判为阴性 。 被检血清孔 （ 图 １ 中的 ⑥ 号孔 ） 与中心抗原孔之间的沉淀线 粗而混浊或标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸 ， 则被检血清孔为非特异反应 ， 应重做 ， 若仍出现非特异反应则判为阴性 。 ５ ． ２ ． ４ 　 介于阴性 、 阳性之间为可疑 。 可疑应重检 ， 仍为可疑判为阳性 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ５ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 规范性附录 ） 马立克氏病病毒抗原琼脂扩散检验的程序 犃 ． １ 　 材料 犃 ． １ ． １ 　 抗原和标准阳性血清 。 犃 ． １ ． ２ 　 溶液 ： ｐＨ７．４ 、 ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液 ； １％ 硫柳汞溶液 ； 生理盐水 。 犃 ． １ ． ３ 　 琼脂板 。 犃 ． ２ 　 操作方法 犃 ． ２ ． １ 　 打孔 犃 ． ２ ． １ ． １ 　 在已制备的琼脂板上 ， 用直径 ４ｍｍ 或 ３ｍｍ 的打孔器按六角形图案打孔 ， 或用梅花形打孔 器打孔 。 中心孔与外周孔距离为 ３ｍｍ 。 犃 ． ２ ． １ ． ２ 　 将孔中的琼脂用 ８ 号针头斜面向上从右侧边缘插入 ， 轻轻向左侧方向挑出 ， 勿损坏孔的边 缘 ， 避免琼脂层脱离平皿底部 。 犃 ． ２ ． １ ． ３ 　 用酒精灯火焰轻烤平皿底部至琼脂轻微融化为止 ， 封闭孔的底部 ， 以防样品溶液侧漏 。 犃 ． ２ ． ２ 　 加样 用微量移液器吸取用灭菌生理盐水稀释的标准阳性血清 （ 按产品使用说明书的要求稀释 ） 滴入中央 孔 ， 标准阳性抗原悬液分别加入外周的第 １ 孔 、 第 ４ 孔中 ， 在外周的第 ２ 、 ３ 、 ５ 、 ６ 孔处按顺序分别插入被 检鸡的羽毛髓质端 （ 长度约 ０．５ｃｍ ）； 或在第 ２ 、 ３ 、 ５ 、 ６ 孔中加入被检的羽髓浸出液 ，