书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ８ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．７ — １９９９ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ８ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 鸡白痢沙门氏菌检验 犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 — 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊狌狉狏犲犻犾犾犪狀犮犲 — 犘犪狉狋 ８ ： 犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳 犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪狆狌犾犾狅狉狌犿 犳狅狉犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测 》 分为 １０ 个部分 ： ——— 第 １ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测总则 ； ——— 第 ２ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 红细胞凝集抑制试验 ； ——— 第 ３ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清中和试验 ； ——— 第 ４ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清平板凝集试验 ； ——— 第 ５ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 琼脂扩散试验 ； ——— 第 ６ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 酶联免疫吸附试验 ； ——— 第 ７ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 胚敏感试验 ； ——— 第 ８ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 鸡白痢沙门氏菌检验 ； ——— 第 ９ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 试管凝集试验 ； ——— 第 １０ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 间接免疫荧光试验 。 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的第 ８ 部分 。 本部分修订参照了 ＮＹ ／ Ｔ５５６ — ２００２ 《 鸡传染性喉气管炎诊断技术 》 和 ＯＩＥ 《 陆生动物 （ 哺乳动物 、 禽鸟和蜜蜂 ） 诊断试验和疫苗手册 》（ 第五版 ） 中的有关规定 。 本部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．７ — １９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 鸡白痢沙门氏菌检验 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．７ — １９９９ 相比主要变化如下 ： ——— 增加了活禽泄殖腔拭子检测样品 ； ——— 增加了沙门氏菌菌体抗原血清学检测方法 ； ——— 增加了附录 Ａ “ 革兰氏染色方法及生化试验结果判定 ”； ——— 对试验操作程序进行了修订 ， 将细菌镜检程序提前 ； ——— 在范围中进一步明确了本部分使用的情况 ； ——— 删除了引用标准 ； ——— 修订了试验操作程序 。 本部分的附录 Ａ 为规范性附录 。 本部分由中华人民共和国农业部提出 。 本部分由全国动物防疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本部分起草单位 ： 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 、 中国动物卫生与流行病学中心 、 济南斯帕法 斯家禽有限公司 。 本部分主要起草人 ： 曲连东 、 姜骞 、 韩凌霞 、 邵卫星 、 朱果 、 单忠芳 、 刘家森 、 司昌德 、 郭东春 、 于海波 、 孟庆文 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．７ — １９９９ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ８ — ２００８ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ８ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 鸡白痢沙门氏菌检验 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的本部分规定了鸡白痢沙门氏菌检验的技术要求 。 本部分适用于对 ＳＰＦ 鸡进行鸡白痢沙门氏菌的分离和鉴定 。 用血清平板凝集试验进行鸡白痢沙门氏菌的抗体检测 ， 结果难以判断时 ， 可采用本部分进行复检 。 ２ 　 原理 取待检样品 （ 肠内容物 、 有关脏器匀浆 、 活禽泄殖腔拭子 ） 接种于增菌培养基中进行增菌 ， 然后将培 养物转移到选择 、 鉴别培养基上培养 ， 挑选可疑菌落接种于营养琼脂培养基上 ， 取培养物进行生化试验 与血清学试验 ， 以确定鸡白痢沙门氏菌 。 ３ 　 试剂和器材 ３ ． １ 　 材料 ３ ． １ ． １ 　 培养基 营养肉汤培养基 、 ＤＨＬ 琼脂 、 ＳＳ 琼脂 、 亚硫酸铋琼脂 （ ＢＳ ）、 三糖铁培养基 （ ＴＳＩ ）、 营养琼脂 、 半固体 琼脂 。 ３ ． １ ． ２ 　 生化反应试剂 糖发酵培养基 、 蛋白胨水 、 硝酸盐培养基 、 氧化酶试剂 、 氨基酸脱羧酶试验培养基 、 尿素培养基 （ 结果 判定见附录 Ａ ）。 ３ ． １ ． ３ 　 沙门氏菌诊断血清 ＡＦ 多价 Ｏ 血清 、 Ｏ９ 因子血清 、 Ｏ１２ 因子血清 、 Ｈａ 因子血清 、 Ｈｄ 因子血清 、 Ｈｇ．ｍ 因子血清和 Ｈｇ．ｐ 因子血清 。 ３ ． ２ 　 器材 ３７℃ 恒温培养箱 。 ４ 　 操作步骤 ４ ． １ 　 采样 无菌采取卵巢 、 肝 、 脾以及小肠和盲肠 ， 活禽泄殖腔拭子 。 ４ ． ２ 　 分离培养 将采集样品放入灭菌乳钵或均浆器中研磨成匀浆 ， 加入少量营养肉汤稀释 。 取培养物或活禽泄殖 腔拭子分别在 ＳＳ 或 ＢＳ 和 ＤＨＬ 琼脂平板培养基上划线接种 ， 置 （ ３６±１ ） ℃ 培养 ２４ｈ ～ ４８ｈ 。 在 ＤＨＬ 培养基上若出现黄褐色透明小菌落 ； 或在 ＳＳ 琼脂平板上出现无色半透明圆形小菌落 ； 或在 ＢＳ 琼脂平 板上出现黑色或黑绿色小菌落 ， 则为可疑菌落 。 如果经 ２４ｈ ～ ４８ｈ 培养后未发现可疑菌落 ， 再取增菌 培养物重复划线分离培养 １ 次 。 ４ ． ３ 　 病原鉴定 ４ ． ３ ． １ 　 镜检 取可疑菌落 ， 涂片作革兰氏染色 ， 具体操作见附录 Ａ 。 镜检可见革兰氏阴性杆菌 ， 大小为 １ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ８ — ２００８ （ ０．３ μ ｍ ～ ０．５ μ ｍ ） × （ １ μ ｍ ～ ２．５ μ ｍ ）， 无芽胞 ， 多单个散在 。 ４ ． ３ ． ２ 　 生化鉴定及运动性检查 ４ ． ３ ． ２ ． １ 　 生化鉴定 接种 ＴＳＩ ， 斜面划线 ， 底部穿刺 ， 置 （ ３６±１ ） ℃ 培养 ２４ｈ 。 其生化反应为斜面呈红色 ， 底层变黄 ， 有或 无气体 ， 不产生硫化氢 （ Ｈ ２ Ｓ ）。 如果符合则进行其他项目的检测及血清学鉴定 ， 不符合则判为阴性 。 ４ ． ３ ． ２ ． ２ 　 运动性试验 将可疑菌落穿刺接种半固体培养基 ，（ ３６±１ ） ℃ 培养 ２４ｈ 后 ， 观察结果 。 鸡白痢沙门氏菌无运 动性 。 ４ ． ３ ． ３ 　 生化项目 发酵葡萄糖产酸或产气 ， 不发酵乳糖和蔗糖 。 触酶 、 赖氨酸脱羧酶 、 硝酸盐还原试验阳性 。 氧化酶 、 尿素酶 、 吲哚试验 、 卫矛醇 、 麦芽糖阴性 。 鸟氨酸脱羧作用阳性 。 ４ ． ４ 　 沙门氏菌 犃 ～ 犉 群多价 犗 血清玻片凝集试验 取可疑培养物接种三糖铁琼脂斜面 ， ３７℃ 培养 １８ｈ ～ ２４ｈ ， 先用 Ａ ～ Ｆ 多价 Ｏ 血清与培养物作平 板凝集反应 ， 若呈阳性 ， 再分别用 Ｏ９ 、 Ｏ１２ 、 Ｈａ 、 Ｈｄ 、 Ｈｇ．ｍ 和 Ｈｇ．ｐ 单价因子血清作平板凝集反应 ， 如果培养物与 Ｏ９ 、 Ｏ１２ 因子血清呈阳性反应 ， 而与 Ｈａ 、 Ｈｄ 、 Ｈｇ．ｍ 和 Ｈｇ．ｐ 因子血清呈阴性反应时 ， 则鉴定为鸡白痢沙门氏菌 。 ５ 　 结果判定 符合上述各项实验结果 ， 为鸡白痢沙门氏菌阳性 ， 否则结果为阴性 。 生化试验和血清学试验不一致 时 ， 以血清学试验为主 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ８ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 规范性附录 ） 革兰氏染色方法及生化试验结果判定 犃 ． １ 　 革兰氏染色法 犃 ． １ ． １ 　 涂片 ， 在火焰上固定 。 犃 ． １ ． ２ 　 滴加结晶紫染色液 ， 染色 １ｍｉｎ ， 流水冲洗 ， 甩干 。 犃 ． １ ． ３ 　 滴加碘液 ， 媒染 １ｍｉｎ ， 流水冲洗 ， 甩干 。 犃 ． １ ． ４ 　 滴加 ９５％ 乙醇脱色约 １５ｓ ～ ３０ｓ ， 流水冲洗 ， 甩干 。 犃 ． １ ． ５ 　 滴加沙黄复红染液 ， 染色 １０ｓ ～ ２０ｓ ， 流水冲洗 ， 甩干 、 风干或滤纸吸干后镜检 。 犃 ． １ ． ６ 　 结果 ： 使用油镜放大 １０００ 倍观察 ， 革兰氏阳性菌呈蓝紫色 ， 革兰氏阴性菌呈红色 。 犃 ． ２ 　 三糖铁琼脂培养基 （ 犜犛犐 ） 结果观察 斜面和高层均变黄者为分解葡萄糖 、 蔗糖和乳糖 ； 高层破碎者为产气 ； 高层变黄而斜面不变或变红 者为分解葡萄糖 ， 不分解蔗糖和乳糖 ； 高层沿接种线变黑者为硫化氢阳性 。 犃 ． ３ 　 靛基质试剂结果观察 培养物中加入柯凡克试剂者 ， 在两种溶液交界处呈红色为阳性 ； 加入欧  波试剂者 ， 在两种溶液交界 处呈玫瑰红为阳性 。 对弱阳性者可先在培养物中加入少量二甲苯 ， 充分混匀后再加入靛基质试剂 。 犃 ． ４ 　 甲基红试验结果观察 向培养物中加入甲基红试剂一滴 ， 立即变为鲜红色为阳性 ， 黄色为阴性 。 犃 ． ５ 　 犞犘 试验结果观察 向培养物中加入 ６％ α  萘酚  乙醇溶液 ０．５ｍＬ ， ４０％ 氢氧化钾溶液 ０．２ｍＬ ， 数分钟内出现红色者为 阳性 ， 不变色为阴性 。 犃 ． ６ 　 硝酸盐培养基结果观察 培养物中先加入甲液 ３ 滴 ～ ５ 滴 ， 再加入乙液 ３ 滴 ～ ５ 滴 ， 出现红色者为阳性 。 犃 ． ７ 　 氧化酶试验结果观察 取滤纸条粘取菌落 ， 加氧化酶试剂一滴 ， ３０ｓ 内呈现红色