书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １８４４８ ． ２ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１８４４８．２ — ２００１ 实验动物 　 弓形虫检测方法 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犪狀犻犿犪犾 — 犕犲狋犺狅犱犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳 犜狅狓狅狆犾犪狊犿犪犵狅狀犱犻犻 ２００８  １２  ０３ 发布 ２００９  ０３  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１８４４８ 《 实验动物 》 由 １０ 项实验动物寄生虫检测方法组成 。 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１８４４８ 的第 ２ 部分 《 实验动物 　 弓形虫检测方法 》。 本部分自实施之日起代替 ＧＢ ／ Ｔ１８４４８．２ — ２００１ 。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１８４４８．２ — ２００１ 相比主要技术差异如下 ： ａ ） 　 增加弓形虫酶联免疫吸附试验 （ ＥＬＩＳＡ ） 和免疫酶染色试验 （ ＩＥＡ ）， 将 ＰＣＲ 检测方法列入附录 内容 ， 保留间接血凝试验 （ ＩＨＡ ） 作为推荐方法之一 ； ｂ ） 　 将检测方法所需的 “ 材料与试剂 ” 和 “ 检测步骤 ” 分别叙述 。 本部分附录 Ａ 是规范性附录 。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口 。 本部分起草单位 ： 全国实验动物标准化技术委员会 。 本部分主要起草人 ： 潘振业 、 屈霞琴 、 陈俏梅 、 李冠民 、 王彦平 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．３４ — １９９４ ， ＧＢ ／ Ｔ１８４４８．２ — ２００１ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １８４４８ ． ２ — ２００８ 实验动物 　 弓形虫检测方法 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１８４４８ 的本部分规定了实验动物弓形虫的检测方法和试剂等 。 本部分适用于小鼠 、 大鼠 、 地鼠 、 豚鼠 、 兔 、 犬及猴等实验动物弓形虫的检测 。 ２ 　 原理 根据免疫学原理 ， 采用弓形虫抗原检测被检动物血清中的弓形虫抗体 。 ３ 　 主要试剂和器材 ３ ． １ 　 试剂 ３ ． １ ． １ 　 ＥＬＩＳＡ 抗原 ３ ． １ ． １ ． １ 　 特异性抗原 弓形虫 （ ＲＨ 株 ） 速殖子腹腔接种清洁级以上实验小鼠 （ ＫＭ 、 ＩＣＲ 、 ＢＡＬＢ ／ ｃ 等均可 ）， ３ｄ ～ ５ｄ 后 ， 以 无菌生理盐水灌洗被接种小鼠的腹腔 ， 收集含有虫体的小鼠腹腔液 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取沉淀 ， ＰＢＳ 洗 ３ 次 。 沉淀物加适量蒸馏水反复冻融 ５ 次 ， 或用超声波处理后 ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３０ｍｉｎ ， 取上 清液 。 上清液用葡聚糖凝胶 Ｇ２００ 进行纯化 （ 柱内径 × 柱高 ： １．５ｃｍ×６０ｃｍ ）， 流速为 ０．２ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 每 管收集 ２ｍＬ 左右 。 共收集 ６０ 管以上 。 分别测定每个收集管中蛋白在 ２８０ｎｍ 下的吸光度值 。 分离纯 化后 ， 出现 ２ 个蛋白峰 ； 将第一峰各管合并 ， 即为弓形虫特异性抗原 （ 也称弓形虫可溶性抗原 ）。 ３ ． １ ． １ ． ２ 　 正常抗原 以无菌生理盐水注射清洁级以上实验小鼠 （ 与制备抗原的小鼠同品种或品系 ） 腹腔 ， ３ｄ ～ ５ｄ 后 ， 以 无菌生理盐水灌洗被注射小鼠腹腔 ， 收集小鼠腹腔液 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取沉淀 ， ＰＢＳ 洗 ３ 次 。 沉淀物加适量蒸馏水反复冻融 ５ 次 ， 或用超声波处理后 ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３０ｍｉｎ ， 取上清液 ， 即为正常 抗原 。 ３ ． １ ． ２ 　 抗原片 弓形虫 ＲＨ 株速殖子腹腔接种清洁级以上实验小鼠 （ ＫＭ 、 ＩＣＲ 、 ＢＡＬＢ ／ ｃ 等均可 ）， ３ｄ ～ ５ｄ 后处 死 ， 收取虫体 ， 胰酶消化 ， 以一定浓度涂片 ， 充分晾干后冷丙酮固定 ， －２０℃ 保存 。 ３ ． １ ． ３ 　 弓形虫抗原致敏绵羊红细胞 将绵羊红细胞与一定浓度的鞣酸液反应 ， 制成鞣化红细胞 ， 然后 ， 用弓形虫可溶性抗原在适宜的条 件下致敏鞣化红细胞 ， 制成弓形虫抗原致敏绵羊红细胞 。 ３ ． １ ． ４ 　 正常对照绵羊红细胞 。 ３ ． １ ． ５ 　 阳性对照血清 自然感染弓形虫的相应动物抗体阳性血清 ， 或弓形虫免疫血清 。 ３ ． １ ． ６ 　 阴性对照血清 确证无弓形虫感染的动物血清 。 ３ ． １ ． ７ 　 酶结合物 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠 、 大鼠 、 地鼠 、 豚鼠 、 兔 、 犬和猴 ＩｇＧ 抗体 ； 或辣根过氧化物酶标记葡 萄球菌蛋白 Ａ （ ＳＰＡ ）。 ３ ． １ ． ８ 　 荧光素结合物 异硫氰氢酸荧光素标记的抗小鼠 、 大鼠 、 地鼠 、 豚鼠 、 兔 、 犬和猴 ＩｇＧ 抗体 。 １ 犌犅 ／ 犜 １８４４８ ． ２ — ２００８ ３ ． １ ． ９ 　 包被液 （ ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ９．６ ） 碳酸钠 　　　　　　　　　　　　　 １．５９ｇ 碳酸氢钠 ２．９３ｇ 蒸馏水 加至 １０００ｍＬ ３ ． １ ． １０ 　 ＰＢＳ （ ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ７．４ ） 氯化钠 ８ｇ 氯化钾 ０．２ｇ 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ） ２．８３ｇ 蒸馏水 加至 １０００ｍＬ ３ ． １ ． １１ 　 洗涤液 ＰＢＳ （ ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ７．４ ） １０００ｍＬ Ｔｗｅｅｎ２０ ０．５ｍＬ ３ ． １ ． １２ 　 稀释液 含 １％ 牛血清白蛋白的 ＰＢＳ 。 ３ ． １ ． １３ 　 磷酸盐  柠檬酸缓冲液 （ ｐＨ５．０ ） 柠檬酸 ３．２６ｇ 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ） １２．９ｇ 蒸馏水 ７００ｍＬ ３ ． １ ． １４ 　 ＥＬＩＳＡ 底物溶液 磷酸盐  柠檬酸缓冲液 （ ｐＨ５．０ ） １０ｍＬ 邻苯二胺 （ ＯＰＤ ） ４ｍｇ ３０％ 过氧化氢 ２ μ Ｌ ３ ． １ ． １５ 　 终止液 （ ２ｍｏｌ ／ Ｌ 硫酸 ） 硫酸 ５８ｍＬ 蒸馏水 ４４２ｍＬ ３ ． １ ． １６ 　 ＩＥＡ 底物溶液 ３ ， ３ 二胺基联苯胺盐酸盐 （ ＤＡＢ ） ４０ｍｇ ＰＢＳ （ ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ７．４ ） １００ｍＬ 丙酮 ５ｍＬ ３０％ 过氧化氢 ０．１ｍＬ ３ ． ２ 　 器材 ３ ． ２ ． １ 　 酶标仪 。 ３ ． ２ ． ２ 　 荧光显微镜 。 ３ ． ２ ． ３ 　 常规的光学显微镜 。 ３ ． ２ ． ４ 　 ３７℃ 培养箱或水浴箱 。 ３ ． ２ ． ５ 　 微量血凝反应板 （ Ｕ 型或 Ｖ 型 ）。 ３ ． ２ ． ６ 　 震荡器 。 ３ ． ２ ． ７ 　 微量加样器 （ ５ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ ）。 ４ 　 检测方法 ４ ． １ 　 间接血凝法 （ 犐犎犃 ） ４ ． １ ． １ 　 取样 ４ ． １ ． １ ． １ 　 采血约 １ｍＬ （ 小鼠 、 大鼠 、 地鼠眶静脉窦采血 ； 豚鼠心脏采血 ； 兔耳部采血 ； 犬和猴后肢静脉采 ２ 犌犅 ／ 犜 １８４４８ ． ２ — ２００８ 血 ）， 凝血试管斜放待凝 ， 置 ４℃ 冰箱 ２ｈ 。 ４ ． １ ． １ ． ２ 　 ２ｈ 后 ， 从冰箱中取出凝血试管 ， 轻轻吸取血清移入另一试管中 。 ４ ． １ ． １ ． ３ 　 将分离出的血清置 ５６℃ 水浴中灭活 ３０ｍｉｎ ， 备用 。 ４ ． １ ． ２ 　 加样 在微量反应板上 ， 依次对每份血清进行倍比稀释 ， 每份血清稀释两横排 ， 每孔留量为 ２５ μ Ｌ 。 同时 设阳性对照 、 阴性对照和空白对照 。 ４ ． １ ． ３ 　 加致敏红细胞 第一横排滴加弓形虫致敏红细胞 ２５ μ Ｌ ， 第二横排滴加正常对照绵羊红细胞 ２５ μ Ｌ 。 将加好样品的 微量反应板置震荡器上震荡 ３ｍｉｎ ～ ５ｍｉｎ ， 使致敏红细胞与待检的稀释血清充分混合 ， 置 １５℃ ～ ２８℃ 室温下过夜后判定结果 。 ４ ． １ ． ４ 　 结果记录 在对照系统 （ 阴性血清对照 、 阳性血清对照 、 空白对照 ） 成立的条件下判定结果 。 ４ ． １ ． ４ ． １ 　 红细胞呈膜状均匀沉于孔底 ， 中央无沉点或沉点小如针尖 ， 记为 “ ＋＋＋＋ ”。 ４ ． １ ． ４ ． ２ 　 红细胞虽呈膜状沉着 ， 但颗粒较粗 ， 中央沉点较大 ， 记为 “ ＋＋＋ ”。 ４ ． １ ． ４ ． ３ 　 红细胞部分呈膜状沉着 ， 周围有凝集团点 ， 中央沉点大 ， 记为 “ ＋＋ ”。 ４ ． １ ． ４ ． ４ 　 红细胞沉集于中心 ， 周围有少量颗粒状沉着物 ， 记为 “ ＋ ”。 ４ ． １ ． ４ ． ５ 　 红细胞沉集于中心 ， 周围无沉着物 ， 分界清楚 ， 记为 “ － ”。 ４ ． １ ． ５ 　 结果判定 出现 “ ＋＋ ” 孔的血清最高稀释倍数定为本间接血凝试验的凝集效价 。 小于或等于 １∶１６ 判为阴 性 ； １∶３２ 判为可疑 ； 等于或大于 １∶６４ 判为阳性 。 ４ ． ２ 　 酶联免疫吸附试验法 （ 犈犔犐犛犃 ） ４ ． ２ ． １ 　 包被抗原 根据滴定的最适工作浓度 ， 将特异性抗原和正常抗原分别用包被液稀释 。 每孔 １００ μ Ｌ ， 置 ３７℃