ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T18649—2014 代替GB/T18649—2002 牛 传染性胸膜肺炎诊断技术 Diagnostictechniquesofcontagiousbovinepleuropneumonia 2014-09-30发布 2015-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国 国家标准 牛传染性胸膜肺炎诊断技术 GB/T18649—2014 * 中国标准出版社出版发行 北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045) 网址:www.gb168.cn 服务热线:400-168-0010 010-68522006 2014年9月第一版 * 书号:155066·1-49775 版权专有 侵权必究 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T18649—2002《牛传染性胸膜肺炎(牛肺疫)诊断技术》。本标准与GB/T18649— 2002相比,主要技术变化如下: ———删除了其中的微量凝集试验; ———修改了其中的补体结合试验; ———增加了聚合酶链式反应(PCR)检测方法和C-ELISA检测方法。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人:辛九庆、李媛。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: ———GB/T18649—2002。 ⅠGB/T18649—2014 牛传染性胸膜肺炎诊断技术 1 范围 本标准规定了牛传染性胸膜肺炎的病原学检查、聚合酶链式反应(PCR)、补体结合试验、竞争 ELISA(C-ELISA)试验诊断技术要求。病原学检查和聚合酶链式反应(PCR)适用于急性、亚急性及慢 性病牛的病原诊断,补体结合试验和竞争ELISA(C-ELISA)试验适用于牛传染性胸膜肺炎感染牛的抗 体检测。 本标准适用于口岸、产地及集散地、养殖企业或养殖户对牛传染性胸膜肺炎的诊断。 2 流行病学 健康牛和病牛接触,由呼吸道吸入病牛的“飞沫”是本病的主要传染途径。在该病的常在地区多见 亚急性和慢性病程,以地方流行性为特点。但在新发生本病地区以急性经过为主。慢性病牛长期带菌, 成为隐蔽的传染源。 3 临床症状 暴发流行时多呈急性病程,体温在41℃以上稽留。呼吸系统症状非常明显,表现为:呼吸困难,呈 腹式呼吸,咳嗽弱而无力,有浆液或脓性鼻汁流出。食欲废绝。 4 病理变化 急性期病变以浆液渗出性纤维素性胸膜肺炎,间质多孔多汁,肺小叶出现各期肝变、多色,呈大理石 样肺,肺胸膜和肋胸膜粘连,以及胸腔渗出液大量潴留为特征。转为慢性后逐渐形成肺包膜或坏死块。 5 病原分离鉴定 5.1 材料准备 10%马血清马丁肉汤和琼脂培养基:见附录A。 5.2 病料采集 用灭菌器械(注射器、剪刀、青霉素瓶、棉拭子等)无菌采集关节液、胸腔积液、鼻腔拭子和全血,关节 液和胸腔渗出液置于青霉素瓶内。 5.3 病料的保存 病料均放入4℃冰箱内保存,并在24h内送到指定实验室。如果在24h内不能送达,应放入 -20℃冰箱内保存。 5.4 培养方法 在无菌条件下吸取胸腔渗出液或关节液0.1mL~0.3mL接种于培养基中即可。鼻腔拭子用 1GB/T18649—2014 5mL灭菌生理盐水(含有100U/mL青霉素)浸泡15min后,吸取0.1mL~0.3mL接种于培养基中 即可。 5.5 结果判定 5.5.1 培养特征 5.5.1.1 培养性状和菌落形态 牛传染性胸膜肺炎病原在10%马血清马丁肉汤内生长初期呈轻微浑浊或呈白色点状、丝状生长, 以后逐渐均匀混浊,半透明稍带乳光,不产生菌膜或沉淀,也无颗粒悬浮。在含有10%马血清的马丁琼 脂培养基上生长迟缓,为极小的水滴状圆形略带灰色的微小菌落,中央有乳头状突起。菌落直径约 0.2mm~0.5mm,肉眼不易看见,需用放大镜或低倍显微镜观察。 5.5.1.2 染色镜检 取马丁肉汤培养物涂片置于温箱中干燥后在酒精灯上轻微火焰固定,再用3%~5%铬酸蒸馏水溶 液固定1min~2min,水洗,浸入用蒸馏水稀释的1∶30姬姆萨氏染液中染色,染液缸放入普通冰箱内 过夜。染色后取出用蒸馏水清洗,自然干燥后用800倍~1000倍显微镜观察。菌型为多形态,以球点 形最常见,大小在125nm~250nm。 5.5.2 生化特征 5.5.2.1 糖发酵试验 在进行糖发酵试验时,将各种糖培养基管(见附录B)加无菌的马血清0.2mL,再加被检菌液 0.1mL置37℃下培养5d~7d。 结果判定:丝状支原体丝状亚种SC型可轻度分解葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉,产酸,使培养基变 黄,而不产气;不能分解果糖、蕈糖、半乳糖和水杨苷。 5.5.2.2 硫化氢(H2S)试验 将被检菌液接种于10%马血清马丁肉汤或琼脂斜面上,取一片乙酸铅滤纸条(见附录C),夹在试 管的棉塞下悬挂,置37℃培养5d~7d,滤纸条变黑或棕褐色为阳性反应。 5.5.2.3 硝酸盐还原试验 向硝酸盐还原培养基(见附录D中D.1)中加10%无菌马血清,然后将被检菌液0.1mL接种于硝 酸盐还原培养基中,同时设不接种的对照,于37℃培养5d~7d。于5d和7d时取1mL培养液置于 干净试管中,再各滴0.1mL试剂甲液和乙液(见D.2),对照管同样加试剂。 结果判定:若试管菌液呈现红色或橙色者为阳性反应;如无红色出现,则可加0.1mL二苯胺试剂, 若呈现蓝色反应,则表示培养基中有硝酸盐存在;如不呈蓝色反应,表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已被 还原成其他物质,则仍判定为硝酸盐还原试验阳性反应。 5.5.2.4 靛基质试验 向靛基质试验培养基(见附录E中E.1)中加入10%无菌马血清,再将被检菌液0.1mL接种于培养 基中,37℃培养5d~7d后,滴加试剂0.1mL于培养物液面,轻轻摇动,红色为阳性反应,黄色为阴性 反应。 2GB/T18649—2014 5.5.2.5 甲基红(MR)试验 按10%的体积向甲基红(MR)试验培养基(见附录F中F.1)中加入无菌马血清,再接种被检菌液 0.1mL,37℃培养。于培养第五天时取1mL培养液于另一支试管中,并加0.1mL试剂,如培养液呈 现红色为MR试验阳性;黄色者为阴性,继续培养至第七天,再进行试验。 5.5.2.6 维培二氏(V-P)试验 可用下列三种试剂进行V-P试验: a) Barritt’s试剂法 取被检菌液2mL加甲液1mL、乙液0.4mL(见附录G中G.1),充分混合,在5min内呈粉红色反 应为阳性。 b) O’Meara’s试剂法 取被检菌液2mL加等量试剂(见G.2)混合,充分振荡试剂,在5min内呈现粉红色者为阳性反应。 c) 硫酸铜试剂法 取被检菌液2mL加等量硫酸铜试剂(见G.3)混合,充分振荡试剂,在5min内呈粉红色反应为 阳性。 上述三种方法为阴性,继续培养,再进行观察。 6 聚合酶链式反应(PCR) 6.1 材料与试剂 6.1.1 引物。 6.1.1.1 特异性引物:SC1和SC2为丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)特异性引物。 6.1.1.2 引物序列。 SC1:ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG; SC2:CTGATTATGATGACAGTGGTCA。 6.1.1.3 引物浓度:浓度为5pmol/μL。 6.1.2 Taq酶(5U/μL)。 6.1.3 电泳缓冲液(TAE)。 6.1.4 琼脂糖:浓度为1.5%。 6.1.5 DNA分子质量标准。 6.2 试验程序 6.2.1 样品的采集与处理 6.2.1.1 组织样品的采集 参照5.2进行。 6.2.1.2 标准阳性样品的处理 用1mL马丁汤培养基(含10%马血清,不含抗生素)溶解冻干菌种后,加入9mL马丁汤内,混匀 后从中吸取1mL菌液加入到下一试管中,共稀释9管,另1管做空白对照。置于37℃培养箱内培养 7d~10d,每日观察,待菌体个数达到每毫升108颜色变化单位(colorchangeunit,CCU)时收获。 3GB/T18649—2014 6.2.2 基因组DNA的提取 使用商品化的基因组DNA提取试剂盒,参照说明书进行操作。 6.2.3 PCR反应 采用20μL反应体系: 10×缓冲液 2.0μL 2.5mmol/LdNTPs 1.6μL 10μmol引物1 1.0μL 10μmol引物2 1.0μL 模板DNA 1.0μL 10u/μLTaq酶 0.5μL 纯水 12.9μL 总体积 20.0μL 瞬时离心,置PCR仪内进行PCR循环。95℃预变性3min;循环94℃45s,57℃45s,72℃ 1min,35个循环后72℃延伸10min。采用常规方法配制的1.5%琼脂糖进行制板并电泳检测。 6.3 PCR产物的判定 6.3.1 标准阳性样品扩增出277bp片段而空白对照不能扩增出任何条带,则PCR反应判定为有效。 如标准阳性样品不能扩增出目的大小片段,或空白对照扩增出目的片段,则反应无效。 6.3.2 在PCR反应有效的前提下,待检样品扩增出的DNA片段为277bp,可判定待检样品为阳性,否 则待检样品为阴性。 7 补体结合试验 7.1 材料准备 7.1.1 试验用巴比妥缓冲液,使用时作1∶5稀释,配制方法见附录H。 7.1.2 绵羊红细胞悬液使用阿氏液,制备方法见附录I。 7.1.3 6%绵羊红细胞悬液制备见附录J。 7.1.4 抗原、标准阳性