书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２１４６ — ２００８ 饲料中洛克沙胂的测定 高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狉狅狓犪狉狊狅狀犲犻狀犪狀犻犿犪犾犳犲犲犱狊 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔 ２００８  ０６  ２７ 发布 ２００８  １０  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 。 本标准负责起草单位 ： 中国农业大学 、 农业部饲料效价与安全监督检验测试中心 （ 北京 ）。 本标准主要起草人 ： 张丽英 、 王金荣 、 杨文军 、 王宗义 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２１４６ — ２００８ 饲料中洛克沙胂的测定 高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了用高效液相色谱法测定饲料中洛克沙胂的含量 。 本标准适用于配合饲料 、 浓缩饲料和添加剂预混合饲料中洛克沙胂的测定 。 本标准定量限为 ５ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ３ 　 原理 用磷酸氢二钾溶液作为提取液 ， 用复合阴离子交换柱萃取柱净化后 ， 经反相 Ｃ １８ 柱分离 ， 采用紫外 检测器检测 ， 根据洛克沙胂的色谱峰保留时间进行定性 ， 以外标法进行定量分析 。 ４ 　 试剂和溶液 除特殊注明外 ， 本标准所用试剂均为分析纯 。 水为符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 二级用水规定 。 ４ ． １ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 磷酸氢二钾溶液 （ ２０ｇ ／ Ｌ ）： 称取 ２０ｇ 磷酸氢二钾 （ Ｋ ２ ＨＰＯ ４ ） 用水溶解 ， 并定容至 １０００ｍＬ 。 ４ ． ３ 　 硫酸铜溶液 （ １００ｇ ／ Ｌ ）： 称取 １０ｇ 硫酸铜 （ ＣｕＳＯ ４ · ５Ｈ ２ Ｏ ） 用水溶解 ， 并定容至 １００ｍＬ 。 ４ ． ４ 　 固相萃取小柱淋洗液与洗脱液 ４ ． ４ ． １ 　 淋洗液 １ ： ６．８０ｇ ／ Ｌ 乙酸钠  甲醇溶液 。 称取 ６．８０ｇ 乙酸钠 （ Ｎａ ２ Ｃ ２ Ｈ ３ Ｏ ２ · ３Ｈ ２ Ｏ ） 于烧杯中 ， 加 入 ８００ｍＬ 水溶解 ， 用 １０％ 乙酸调 ｐＨ 至 ７ ， 加入 ５３ｍＬ 甲醇 ， 定容至 １０００ｍＬ ， ４℃ 贮存 。 ４ ． ４ ． ２ 　 淋洗液 ２ ： 无水甲醇 。 ４ ． ４ ． ３ 　 洗脱液 ： ５％ 甲酸甲醇溶液 ， 吸取 ５ｍＬ 甲酸 ， 用无水甲醇定容至 １００ｍＬ 。 ４ ． ５ 　 流动相 ４ ． ５ ． １ 　 Ａ 液 ： 含 ０．１％ 甲酸的 ６．９８ｇ ／ Ｌ 磷酸二氢钾溶液 ， 称取 ６．９８ｇ 磷酸二氢钾 （ ＫＨ ２ ＰＯ ４ ） 于烧杯 中 ， 用水溶解 ， 加入 １ｍＬ 甲酸溶液 ， 并定容至 １０００ｍＬ 。 ４ ． ５ ． ２ 　 Ｂ 液 ： 无水甲醇 。 ４ ． ６ 　 洛克沙胂标准溶液 ４ ． ６ ． １ 　 标准贮备液 ： 准确称取洛克沙胂标准品 （ 含量 ≥ ９９％ ） ５００ｍｇ ， 置于 １０００ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用 磷酸氢二钾溶液 （ ４．２ ） 超声溶解 ， 配制成 ５００ μ ｇ ／ ｍＬ 标准贮备液 ， 贮于 ４℃ 冰箱中 。 ４ ． ６ ． ２ 　 标准工作液 ： 吸取标准贮备液 （ ４．６．１ ） ０．２ 、 ０．４ 、 ０．６ 、 ０．８ 、 １．０ｍＬ 分别至 ５０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 并用磷酸氢二钾溶液 （ ４．２ ） 稀释至刻度 ， 摇匀 。 其浓度分别为 ２．０ 、 ４．０ 、 ６．０ 、 ８．０ 、 １０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 的标准工 作液 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２１４６ — ２００８ ５ 　 仪器 、 设备 ５ ． １ 　 分析天平 ： 感量为 ０．０００１ｇ 。 ５ ． ２ 　 离心机 ： 转速能达 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ ～ ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ ． ３ 　 固相萃取 （ ＳＰＥ ） 装置 。 ５ ． ４ 　 恒温水浴和氮吹仪 。 ５ ． ５ 　 涡旋混合器 。 ５ ． ６ 　 复合阴离子固相萃取小柱 。 ５ ． ７ 　 高效液相仪 （ 配有紫外检测器 ）。 ５ ． ８ 　 超声波仪 。 ６ 　 试样制备 按照 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 规定方法采样 ， 采取样品量至少 ５００ｇ ， 以四分法缩减至 ２００ｇ ， 粉碎过孔径 ０．４５ｍｍ 目筛 ， 充分混匀 ， 装瓶 ， 备用 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 试样溶液的准备 ７ ． １ ． １ 　 提取 准确称取适量试样 （ 配合饲料 ５ｇ ， 浓缩饲料 ２ｇ ， 添加剂预混合饲料 １ｇ ， 准确至 ０．０００１ｇ ） 于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 加磷酸氢二钾溶液 （ ４．２ ） ４０ｍＬ ， 盖好管盖 ， 充分振摇后 ， 在 ６０℃ 超声水浴上提取 ３０ｍｉｎ ， 然后于离心机以 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 上清液倒入 １００ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 残渣再分别用 上述提取剂 ３０ｍＬ 、 ２０ｍＬ 重复提取 ２ 次 ， 每次 １５ｍｉｎ ， 离心后合并上清液于 １００ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 然 后加硫酸铜溶液 （ ４．３ ） ２ｍＬ ， 并用磷酸氢二钾溶液 （ ４．２ ） 稀释至刻度 ， 摇匀 ， 过滤 ， 滤液待用 。 浓缩饲料和添加剂预混合饲料的滤液需分别做 ２ 倍和 ５ 倍稀释 。 ７ ． １ ． ２ 　 净化 将固相萃取柱 （ ５．６ ） 固定于 ＳＰＥ 系统 （ ５．３ ） 上 ， 依次用 １．０ｍＬ 甲醇和 １．０ｍＬ 水活化 、 平衡 ＳＰＥ 小 柱 （ ５．６ ）。 吸取 ７．１．１ 得到的样品提取滤液 １ｍＬ 加到 ＳＰＥ 小柱上 ， 控制过柱流速不超过 １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ ， 然后依次用乙酸钠  甲醇溶液 （ ４．４．１ ） 和无水甲醇溶液 （ ４．４．２ ） 各淋洗一次 ， 最后用 １．０ｍＬ 洗脱液 （ ４．４．３ ） 洗脱 ， 洗脱速度不超过 １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 洗脱液于 ６５℃ 水浴中以氮气吹干 ， 准确加入 １．０ｍＬ 磷 酸氢二钾溶液 （ ４．２ ） 充分溶解混匀 ， 并转移到样品瓶中 ， 盖好 ， 待用 。 ７ ． ２ 　 色谱条件 ７ ． ２ ． １ 　 色谱柱 ： 具有 Ｃ １８ 填料的柱子 （ 粒径为 ３ μ ｍ ）， 内径 ３．９ｍｍ ， 柱长 １５０ｍｍ 。 ７ ． ２ ． ２ 　 流动相 ： Ａ 液 （ ４．５．１ ） ＋Ｂ 液 （ ４．５．２ ） ＝９５＋５ （ 体积比 ）， 以 １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ 流速洗脱 。 ７ ． ２ ． ３ 　 进样体积 ： ２０ μ Ｌ 。 ７ ． ２ ． ４ 　 检测器 ： 紫外检测器 （ 或二极管矩阵检测器 ）， 检测波长 ２６６ｎｍ 。 ７ ． ３ 　 定量方法 按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数 。 向色谱柱中注入洛克沙胂标准工作液 （ ４．６．２ ） 及试 样溶液 （ ７．１．２ ）， 得到色谱峰面积响应值 ， 用外标法定量 。 ８ 　 结果计算与表述 ８ ． １ 　 试样中洛克沙胂含量 （ 狑 ） 以质量分数计 ， 数值以毫克每千克 （ ｍｇ ／ ｋｇ ） 表示 ， 按照式 （ １ ） 计算 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２１４６ — ２００８ 狑 ＝ ρ 犿 × 犓 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： ρ ——— 根据标准曲线计算的上机试样溶液中洛克沙胂含量 ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）； 犿 ——— 试样质量 ， 单位为克 （ ｇ ）； 犓 ——— 稀释倍数 。 ８ ． ２ 　 测定结果用平行测定的算术平均值表示 ， 保留 ３ 位有效数字 。 ９ 　 重复性 同一实验室同一操作人员使用同一台仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于 １０％ 。 犌犅 ／ 犜 ２２１４６ — ２００８