书 书 书犐犆犛 ６７ ． １００ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２２８７ — ２００８ 贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通 犚犜 — 犘犆犚 方法和 实时荧光 犚犜 — 犘犆犚 方法 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犺犲狆犪狋犻狋犻狊犪狏犻狉狌狊犻狀狊犺犲犾犾犳犻狊犺 — 犆狅狀狋犲狀狋犻狅狀犪犾犚犜 — 犘犆犚犪狀犱狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜 — 犘犆犚 ２００８  ０８  １２ 发布 ２００８  １２  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为规范性附录 。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、 中华人民共和国江苏出入境检验检 疫局 。 本标准主要起草人 ： 陈广全 、 饶红 、 段洪安 、 冯骞 、 付溥博 、 张惠媛 、 汪琦 、 曾静 、 张睿 、 李金华 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２２８７ — ２００８ 贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通 犚犜 — 犘犆犚 方法和 实时荧光 犚犜 — 犘犆犚 方法 １ 　 范围 本标准规定了贝类中甲型肝炎病毒的普通 ＲＴ — ＰＣＲ 和荧光 ＲＴ — ＰＣＲ 检测方法 。 本标准适用于贝类中甲型肝炎病毒核酸的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ＧＢ１９４８９ 　 实验室生物安全通用要求 ＳＮ ／ Ｔ１１９３ 　 基因分析检测实验室技术要求 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 聚合酶链式反应 　 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 ， 犘犆犚 ＤＮＡ 模板先经高温变性为单链 ， 在适宜的温度下和缓冲液中 ， 两条引物分别与模板 ＤＮＡ 两条链 上的一段互补序列发生退火 ， 接着在 ＤＮＡ 聚合酶的催化下以四种 ｄＮＴＰ 为底物 ， 使退火引物得以延 伸 ， 如此反复变性 、 退火和延伸 ， 使位于两段引物序列之间的 ＤＮＡ 片段呈几何倍数扩增 。 ３ ． ２ 反转录  聚合酶链式反应 　 狉犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 ， 犚犜 — 犘犆犚 ＲＮＡ 在逆转录酶的作用下 ， 适宜反应条件下 ， 被逆转录成 ｃＤＮＡ ， 以 ｃＤＮＡ 作为模板进行 ＰＣＲ 。 ３ ． ３ 实时荧光 犚犜 — 犘犆犚 　 狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜 — 犘犆犚 实时荧光 ＲＴ — ＰＣＲ 方法是在常规 ＲＴ — ＰＣＲ 的基础上 ， 加入一条特异性的荧光探针 。 该探针为 一段寡核苷酸 ， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团 。 探针完整时 ， 报告基团发射的荧 光信号被淬灭基团吸收 ； ＰＣＲ 扩增时 ， 犜犪狇 酶的 ５ ’ ３ ’ 外切酶活性将探针酶切降解 ， 使报告荧光基团和 淬灭荧光基团分离 ， 从而荧光监测系统可以接收到荧光信号 ， 即每扩增一条 ＤＮＡ 链 ， 就有一个荧光分 子形成 ， 实现了荧光信号的累积与 ＰＣＲ 产物形成完全同步 。 ３ ． ４ 犆狋 值 　 犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本标准 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２２８７ — ２００８ ４ ． １ 　 ＨＡＶ ： 甲型肝炎病毒 。 ４ ． ２ 　 ＴＣＩＤ ５０ ： 组织培养半数感染量 ， 是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度 ， 一般使用 Ｒｅｅｄ Ｍｕｅｎｃｈ 方法计算 。 ５ 　 试剂 除有特殊说明外 ， 所有实验用试剂均为分析纯 ； 实验用水均为去离子水 ， 规格符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 相关 规定 。 ５ ． １ 　 甘氨酸缓冲液 ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．１．１ 。 ５ ． ２ 　 ＰＥＧ８０００ 沉降液 ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．１．２ 。 ５ ． ３ 　 裂解液 ： Ｔｒｉｚｏｌｒｅａｇｅｎｔ 或其他等效产品 。 ５ ． ４ 　 Ｐｏｌｙ （ ｄｔ ） 磁珠 ： Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓｏｌｉｇｏ （ ｄｔ ） ２５ 或其他等效产品 。 注 ： 给出这一信息是为了方便本标准使用者 ， 并不表示对该产品的认可 。 如果其他等效产品具有相同的效果 ， 则可 使用这些等效产品 。 ５ ． ５ 　 １ ⅹ ＲＮＡ 吸附缓冲液 ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．２．５ 。 ５ ． ６ 　 ２ ⅹ ＲＮＡ 吸附缓冲液 ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．２．６ 。 ５ ． ７ 　 洗涤缓冲液 ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．２．７ 。 ５ ． ８ 　 ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡＭｉｎｉＫｉｔ （ Ｑｉａｇｅｎ５２９００４ ） １ ） 或其他等效产品 。 ５ ． ９ 　 Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＴＭ ｏｎｅｓｔｅｐＲＴ — ＰＣＲｗｉｔｈｐｌａｔｉｎｕｍＴａｑ （ ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔ．Ｎｏ．１０９２８０３４ ） １ ） 或其他 等效产品 。 ５ ． １０ 　 Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＴＭ ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｓｙｈｔｈｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ — ＰＣＲ （ ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔ．Ｎｏ．１８０８００５１ ） １ ） 或 其他等效产品 。 １ ） 　 给出这一信息是为了方便本标准使用者 ， 并不表示对该产品的认可 。 如果其他等效产品具有相同的效果 ， 则可 使用这些等效产品 。 ５ ． １１ 　 ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ （ ＡＢＩ４３０４４３７ ） １ ） 或其他等效产品 。 ５ ． １２ 　 普通 ＲＴ — ＰＣＲ 检测引物序列 （ ５ ’ ３ ’） 正义引物 （ Ｎｏ．Ｐ１ ） 　　　　 ＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＴＧＡＧ 反义引物 （ Ｎｏ．Ｐ２ ） ＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣ 　　 引物位于 ＨＡＶ 基因组中编码 ＶＰ１－ＶＰ３ 壳蛋白的区域 ， 目的片段长度为 １９２ｂｐ 。 加无 ＲＮａｓｅ 的去离子水配制成 １００ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 储备液 。 ５ ． １３ 　 实时荧光 ＲＴ — ＰＣＲ 检测的引物和探针 引物或探针序列 （ ５ ’ ３ ’） 正义引物 （ ＨＡＶ１ ） ＴＴＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＴＧ 反义引物 （ ＨＡＶ２ ） ＡＡＡＧＧＧＡＡＡＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＡＧＣＣ 反义引物 （ ＨＡＶ３ ） ＡＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＡＧＣＣ 探针 ＦＡＭ — ＡＣＴＴＧＡＴＡＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＧＣＣＴ — ＴＡＭＲＡ 加无 ＲＮａｓｅ 的去离子水配制成 １００ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 储备液 。 ５ ． １４ 　 ＤＮＡ 分子量标记 ： １００ｂｐ ～ ２０００ｂｐ 。 ５ ． １５ 　 ５０ ⅹ ＴＡＥ 或其他等效缓冲液 ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．１．３ 。 ５ ． １６ 　 １０ ⅹ 上样缓冲液 ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．１．６ 。 ５ ． １７ 　 甲肝减毒活疫苗 ： 作为阳性对照添加于已知的阴性贝类样品中制成阳性质控样品 。 ５ ． １８ 　 三氯甲烷 ： 每次使用时注意防止 Ｒｎａｓｅ 污染 。 ５ ． １９ 　 异丙醇 ： 每次使用时注意防止 Ｒｎａｓｅ 污染 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２２８７ — ２００８ ５ ． ２０ 　 ７５％ 乙醇 ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．２．４ 。 ５ ． ２１ 　 无 ＲＮａｓｅ 的去离子水 ： 见附录 Ａ 中的 Ａ．２．３ 。 ５ ． ２２ 　 溴化乙锭 （ １０ μ ｇ ／ μ Ｌ ）： 见附录 Ａ 中的 Ａ．１．４ 。 ５ ． ２３ 　 焦碳酸二乙酯 。 ６ 　 仪器与设备 ６ ． １ 　 组织匀浆器 （ ０ｒ ／ ｍｉｎ ～ ２００００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 ６ ． ２ 　 ＰＣＲ 仪 （ ＰＥ９６００ 或其他等效设备 ）。 ６ ． ３ 　 实时荧光 ＰＣＲ 仪 （ ＡＢＩ７０００ 或其他等效设备 ）。 ６ ． ４ 　 凝胶成像系统 。 ６ ． ５ 　 恒温水浴 （ １０℃ ～ ９５℃ ）。 ６ ． ６ 　 涡旋混匀器 （ ２００ｒ ／ ｍｉｎ ～ ２５００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 ６ ． ７ 　 电泳仪 （ ０Ｖ ～ ３００Ｖ ）。 ６ ． ８ 　 酸度计 （ ０ ～ １４．００ｐＨ ， 最小显示单位 ０．０１ｐＨ ， １ｍＶ ）。 ６ ． ９ 　 高速冷冻离心机 （ ＭｅｃｋｍａｎｍｏｄｅｌＪ２２１ 或其他等效设备 ）。 ６ ． １０ 　 微量加样器 （ ０．１ μ Ｌ ～ ２ μ Ｌ ， １ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ ， ２０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ ， １０００ μ Ｌ ～ ５０００ μ Ｌ ）。 ６ ． １１ 　 超低温冰箱 （ －８０℃ ）。 ６ ． １２ 　 带滤心的无 Ｒｎａｓｅ 的微量加样器吸头 （ １０ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ， ２００ μ Ｌ ， １ｍＬ ）。 ６ ． １３ 　 无 ＲＮａｓｅ