书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２３３２ — ２００８ 鸭病毒性肠炎诊断技术 犇犻犪犵狀狅狊狋犻犮狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊犳狅狉犱狌犮犽狏犻狉狌狊犲狀狋犲狉犻狋犻狊 ２００８  ０８  ２２ 发布 ２００８  １２  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准部分技术采用 ＯＩＥ 《 陆生动物诊断试验和疫苗手册 》（ ２００４ ） 推荐的试验方法 ， 并把具体操作 程序予以细化 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 华南农业大学 、 中华人民共和国广东出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 郭霄峰 、 廖明 、 洪洁心 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２３３２ — ２００８ 鸭病毒性肠炎诊断技术 １ 　 范围 本标准规定了鸭病毒性肠炎病毒 （ ＤＶＥＶ ） 分离和鉴定及聚合酶链式反应 （ ＰＣＲ ） 试验的诊断技术 要求 。 本标准适用于鸭病毒性肠炎的诊断 。 ２ 　 临床症状和病理变化 家养的鸭和雏鸭从 ７ 日龄至成年均可感染发病 。 在易感鸭群 ， 初始症状通常为突发持续性高死亡 现象 ， 产蛋量明显下降 。 由于感染禽的品种 、 年龄 、 性别以及病毒毒力的不同 ， 暴发鸭病毒性肠炎 （ ＤＶＥ ） 后临床症状 、 剖检病变有很大的差异 。 种鸭临床症状为流泪 、 怕光 、 烦渴 、 缺乏食欲 、 共济失调 、 水样腹泻和流鼻液 。 通常病鸭羽毛蓬乱 ， 肛门粘有污物 。 病鸭借助翅膀支撑方能保持平衡 ， 整个外观虚 弱 、 精神沉郁 。 但 ２ 周 ～ ７ 周龄鸭中损失比成鸭低 ， 其症状为脱水 、 体重下降 ， 喙呈蓝色 ， 肛门染有血迹 。 剖检时发现 ， 死亡的鸭并不消瘦 。 性成熟的公鸭的阴茎可能脱垂 。 性成熟母禽的卵巢滤泡出血 。 特征性大体病变以血管受损 ， 带有组织出血和体腔游离血液 ， 消化道粘膜表面有环状出血和白喉样损 坏 ， 淋巴样器官受损 ， 实质器官呈退行性病变为特征 。 白色北京鸭的特征性病变是血管及内脏器官损 伤 ， 消化道上皮细胞出现嗜酸性核内包涵体和胞浆内包涵体 。 ３ 　 病毒分离 ３ ． １ 　 材料准备 ３ ． １ ． １ 　 病料的采集 ： 一般应在感染初期或发病急性期从濒死期禽或活禽采取 。 濒死期禽采集肝 、 脾 、 脑 等组织样品 。 活禽用灭菌的棉拭子涂抹泄殖腔 。 带有分泌物的棉拭子放入每毫升含有 １０００ＩＵ 青霉 素 ， １０００ μ ｇ 链霉素 ， ｐＨ７．２ ～ ７．６ 的磷酸盐缓冲液 （ ＰＢＳ ） 中 。 送检病料应置于 ５０％ 的甘油生理盐 水中 。 ３ ． １ ． ２ 　 病料的保存 ： 采集的样品若在 ４８ｈ 内处理 ， 可于 ４℃ 保存 ； 否则应放 －２０℃ 以下保存 （ －７０℃ 贮存最好 ）。 ３ ． １ ． ３ 　 病料的处理 ： 将棉拭子充分捻动 、 拧干后除去拭子 。 样品液经 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ４℃ 离心 ３０ｍｉｎ ， 取 上清液作为接种材料 。 组织样品先用 ｐＨ７．２ ～ ７．６ 的 ＰＢＳ 制成 ５ 倍 ～ １０ 倍乳剂 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ４℃ 离心 ３０ｍｉｎ ， 取上清液作为接种材料 。 为防止细菌污染 ， 可在样品液中加入青霉素 （ １０００ＩＵ ／ ｍＬ ）， 链霉素 （ １０００ μ ｇ ／ ｍＬ ）， 卡那霉素 （ １０００ μ ｇ ／ ｍＬ ）， ３７℃ 温箱中作用 ３０ｍｉｎ 。 进行无菌检验 。 ３ ． １ ． ４ 　 鸭胚 ： １０ 日 ～ １１ 日龄的非 ＤＶＥ 疫苗免疫鸭胚 。 ３ ． ２ 　 实验操作 ３ ． ２ ． １ 　 胚胎接种 ： 取经处理并且无菌检验合格的样品 ， 以 ０．２ｍＬ ／ 胚的量经绒毛尿囊膜接种 １０ 日 ～ １１ 日龄的非 ＤＶＥ 疫苗免疫的鸭胚 ， 每个样品接种 ４ 个 ～ ５ 个胚 ， 于 ３８℃ ～ ３８．５℃ 恒温箱中孵育 。 ７２ｈ 前每天照胚 １ 次 ～ ２ 次 ， 以后每天照胚 ５ 次 。 弃去 ７２ｈ 前死亡的胚胎 ， 冻存 ７２ｈ ～ １２０ｈ 内的死胚 或活胚 。 ３ ． ２ ． ２ 　 病毒收获 ： 无菌收取 ７２ｈ ～ １２０ｈ 内的死胚或活胚的绒毛尿囊膜和尿囊液 ， －２０℃ 保存备用 。 ３ ． ２ ． ３ 　 如第一代分离结果为阴性 ， 需盲传三代 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２３３２ — ２００８ ４ 　 犘犆犚 ４ ． １ 　 引物 Ｐ１ ： ＧＡＧＣＧＴＡＴＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＴＧＣ （ 上游 ） Ｐ２ ： ＴＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＧＴＴＣ （ 下游 ） ４ ． ２ 　 病毒核酸的抽提 ４ ． ２ ． １ 　 组织样品用 ｐＨ７．２ ～ ７．６ 的 ＰＢＳ 制成 ５ 倍 ～ １０ 倍乳剂 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ４℃ 离心 ３０ｍｉｎ ， 上清液作 为待检材料 。 ４ ． ２ ． ２ 　 取一支 １．５ｍＬ 的指形管 ， 加入 ４００ μ Ｌ 待检胚液或 ４．２．１ 上清液和 ３０ μ Ｌ （ ２０ｍｇ ／ ｍＬ ） 核糖核 酸酶 ， 混匀后 ， 室温下作用 ２０ｍｉｎ 。 ４ ． ２ ． ３ 　 加 ４３ μ Ｌ１０％ 的十二烷基磺酸钠溶液和 ５ μ Ｌ （ １０ｍｇ ／ ｍＬ ） 蛋白酶 Ｋ ， ４２℃ 水浴温育过夜 。 ４ ． ２ ． ４ 　 加等量的 Ｔｒｉｓ 盐酸饱和酚 （ ｐＨ７．６ ）， 充分混匀 ， １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 小心吸出上层水相于 另一个指形管中 。 ４ ． ２ ． ５ 　 加等量的酚  三氯甲烷  异戊醇 （ ２５∶２４∶１ ）， 充分混匀 ， １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 小心吸出上层 水相于另一个指形管中 。 ４ ． ２ ． ６ 　 加 １ ／ １０ 体积 ３ｍｏｌ ／ Ｌ 的乙酸钠 （ ｐＨ５．４ ）， ２．５ 倍体积预冷的无水乙醇 ， １５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０ｍｉｎ ， 弃去乙醇 ， 沉淀用 ７５％ 的乙醇洗涤一次 ， 真空干燥 。 用 ２０ μ Ｌ 灭菌双蒸水溶解沉淀 ， －２０℃ 保 存备用 。 ４ ． ３ 　 操作程序 取一支 ０．５ｍＬ 的指形管 ， 依次加入下列试剂 ： ２．５ μ Ｌ１０× 的 ＰＣＲ 缓冲液 ， １．０ μ Ｌ 上游引物 ， １．０ μ Ｌ 下游引物 ， ０．５ μ ＬｄＮＴＰ ， １．０ μ Ｌ 病毒核酸 ， １８．５ μ Ｌ 灭菌双蒸水 ， ０．５ μ Ｌ 犜犪狇 ＤＮＡ 酶 。 于 ＰＣＲ 仪中运行 ： ９４℃３０ｓ ， ５５℃３０ｓ ， ７２℃３０ｓ ， ２５ 个循环 ， ７２℃８ｍｉｎ 。 同时设立阳性和阴性对照 。 ４ ． ４ 　 犘犆犚 产物的检测 反应结束后 ， ＰＣＲ 产物于 １．２％ 的琼脂糖凝胶中电泳 ， 每个样品的加样量为 ５ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ ， 同时以 １００ｂｐＤＮＡ 分子质量标准物为参照 。 ５０Ｖ 恒压电泳 ４０ｍｉｎ ， 于紫外灯下观察 。 ４ ． ５ 　 结果的判定 阳性对照在 ４１６ｂｐ 处有一条特异的 ＤＮＡ 条带 ， 阴性对照没有目的带 ， 证明本实验成立 。 待检样品 在相同位置有 ＤＮＡ 带 ， 判为阳性 ， 否则为阴性 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２３３２ — ２００８