书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２９１６ — ２００８ 水泡性口炎病毒荧光 犚犜犘犆犚 检测方法 犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犳犾狌狅狉狅犵犲狀犻犮犚犜犘犆犚犳狅狉狏犲狊犻犮狌犾犪狉狊狋狅犿犪狋犻狋犻狊狏犻狉狌狊 　　 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准参考了世界动物卫生组织 （ ＯＩＥ ）《 陆生动物诊断试验和疫苗手册 （ 哺乳动物 、 禽鸟与蜜蜂 ）》 （ 第 ５ 版 ）。 本标准的附录 Ａ 为规范性附录 ， 附录 Ｂ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、 中华人民共和国云南出入境检验检 疫局 。 本标准主要起草人 ： 花群义 、 周晓黎 、 曾少灵 、 曹琛福 、 詹爱军 、 张彩虹 、 林庆燕 、 陈兵 、 杨云庆 、 孙洁 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２９１６ — ２００８ 水泡性口炎病毒荧光 犚犜犘犆犚 检测方法 １ 　 范围 本标准规定了水泡性口炎病毒荧光 ＲＴＰＣＲ 检测的操作方法 。 本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测 。 ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本标准 。 ２ ． １ 　 荧光 犚犜犘犆犚 荧光反转录  聚合酶链反应 。 ２ ． ２ 　 犆狋 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 ２ ． ３ 　 犚犖犃 核糖核酸 。 ２ ． ４ 　 犇犈犘犆 焦碳酸磷酯 。 ２ ． ５ 　 犘犅犛 磷酸盐缓冲盐水 （ 配方见附录 Ａ ）。 ２ ． ６ 　 犜犪狇 酶 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 。 ２ ． ７ 　 犞犛犞 水泡性口炎病毒 。 ３ 　 原理 水泡性口炎病毒属 ＲＮＡ 病毒 ， 根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列 ， 合成一对特异性引 物和一条特异性的荧光双标记探针 。 通过严格设计和筛选的引物和探针 ， 涵盖水泡性口炎病毒的两个 型和突变株 ， 为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针 。 探针的 ５′ 端标记 ＦＡＭ 荧光素 ， 它发出的荧 光能够被检测仪器接收 ， 称为报告荧光基团 ； ３′ 端标记 ＴＡＭＲＡ 荧光素 ， 它在近距离内能吸收 ５′ 端报告 荧光基团发出的荧光信号 ， 称为淬灭荧光基团 。 在扩增时 ， 犜犪狇 酶发挥它的 ５′ → ３′ 端外切核酸酶的功 能 ， 将探针水解成单核苷酸 ， 消除阻碍 ， 标记在探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团均游离于溶液 中 ， 仪器检测到发出的荧光信号 。 ４ 　 材料与试剂 ４ ． １ 　 仪器与器材 ４ ． １ ． １ 　 荧光 ＲＴＰＣＲ 检测仪 。 ４ ． １ ． ２ 　 高速台式冷冻离心机 （ 离心速度 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 以上 ）。 ４ ． １ ． ３ 　 台式离心机 （ 离心速度 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 ４ ． １ ． ４ 　 混匀器 。 ４ ． １ ． ５ 　 冰箱 （ ２℃ ～ ８℃ 和 －２０℃ 两种 ）。 ４ ． １ ． ６ 　 微量可调移液器 （ ５ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ， １０００ μ Ｌ ） 及配套带滤芯吸头 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２９１６ — ２００８ ４ ． １ ． ７ 　 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 （ １．５ｍＬ ）、 透明薄壁 ＰＣＲ 管 （ ０．２ｍＬ ）。 ４ ． ２ 　 试剂 ４ ． ２ ． １ 　 除特别说明以外 ， 本标准所用试剂均为分析纯 ， 所有试剂均用无 ＲＮＡ 酶污染的容器 （ 用 ＤＥＰＣ 水处理后高压灭菌 ） 分装 。 ４ ． ２ ． ２ 　 三氯甲烷 。 ４ ． ２ ． ３ 　 异丙醇 ： －２０℃ 预冷 。 ４ ． ２ ． ４ 　 ＰＢＳ ： 配方见附录 Ａ 。 ４ ． ２ ． ５ 　 ７５％ 乙醇 ： 用新开启的无水乙醇和 ＤＥＰＣ 水配制 ， －２０℃ 预冷 。 ４ ． ２ ． ６ 　 水泡性口炎病毒荧光 ＲＴＰＣＲ 检测试剂盒 ： 组成 、 功能及使用注意事项参见附录 Ｂ 。 ４ ． ２ ． ７ 　 引物 ： 上游引物为 ５′ＡＴＧＧＣＴＣＣＴＡＣＡＧＴＴＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡ３′ ， 下游引物为 ５′ＴＧＡＡＧ ＴＡＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＴＡＴＴＣ３′ 。 ４ ． ２ ． ８ 　 荧光双标记探针 （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）：（ ＦＡＭ ） ５′ＣＧＡＡＡＴＴＡＣＣＧＧＣＣＡＡＣＧＡＧＧＡＴＣ３′ （ ＴＡＭ ＡＲ ）。 扩增目标片段长度为 ９７ｂｐ 。 ５ 　 抽样 ５ ． １ 　 采样工具 ５ ． １ ． １ 　 下列采样工具应经 １２１℃±２℃ ， １５ｍｉｎ 高压灭菌并烘干 。 ５ ． １ ． ２ 　 棉拭子 。 ５ ． １ ． ３ 　 剪刀 、 镊子 。 ５ ． １ ． ４ 　 注射器 。 ５ ． １ ． ５ 　 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 。 ５ ． １ ． ６ 　 研钵 。 ５ ． ２ 　 样品采集 ５ ． ２ ． １ 　 采集的样品主要是口腔 、 蹄冠上的水泡上皮组织 、 水泡液 、 血液 、 口腔分泌物和组织 。 采集后立 即冷藏送检或放入含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液中于 ４℃ 环境中保藏 。 编号并作好记录 。 ５ ． ２ ． ２ 　 水泡液及水泡皮 ： 只有当水泡完整时才能采集到水泡液 。 水泡一旦出现很快就会破溃 ， 所以要 不失时机地采集水泡液 。 首先用 ７５％ 酒精轻轻消毒水泡表皮 ， 尽量去掉污物 ， 用灭菌生理盐水擦去酒 精 ， 然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液 ， 置于含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液灭菌瓶中 。 ５ ． ２ ． ３ 　 水泡液采取后 ， 将水泡皮以无菌术剪下 ， 放入含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液中 。 若水泡已经破溃 ， 则 只能采集破溃的水泡皮 ， 用灭菌生理盐水涮洗掉水泡皮上的污物 ， 放入上述缓冲液中 。 ５ ． ２ ． ４ 　 口腔分泌物和咽喉拭子 ： 用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮 ３ 次 ～ ５ 次取分泌 液 ， 拭子一并放入盛有 １．０ｍＬ 含抗生素的 ＰＢＳ 缓冲液的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 。 也可用食道探杯刮 取咽喉液体 ， 放入加有抗生素的 ＰＢＳ 中 。 编号 ， 冷藏送检或低温保藏 。 ５ ． ２ ． ５ 　 血液 ： 用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 ， 密封 、 编号后保存于 ４℃ 环 境中送检 。 ５ ． ２ ． ６ 　 肌肉或组织脏器 ： 无菌采集待检样品 ， 装入一次性塑料袋或其他灭菌容器 ， 编号 ， 冷藏送检或低 温保藏 。 ５ ． ３ 　 样品贮运 样品采集后 ， 放入密闭的塑料袋内 （ 一个采样点的样品 ， 放入一个塑料袋内 ）， 于保温箱中加冰 、 密 封 ， 送实验室 。 ５ ． ４ 　 样品制备 ５ ． ４ ． １ 　 水泡液 、 口腔分泌物 、 血液和精液 样品在混匀器上充分混合后 ， 用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出 ， 室温放置 ３０ｍｉｎ ， 取上清液转 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２９１６ — ２００８ 入无菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 ， 编号备用 。 ５ ． ４ ． ２ 　 水泡皮 、 肌肉或组织脏器 取待检样品 ２．０ｇ 于洁净 、 灭菌并烘干的研钵中充分研磨 ， 加 １０ｍＬＰＢＳ 混匀 ， ４℃ 下以 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ｍｉｎ ， 取上清液转入无菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中 ， 编号备用 。 ５ ． ５ 　 样本存放 制备的样本在 ２℃ ～ ８℃ 条件下保存应不超过 ２４ｈ ， 若需长期保存应置于 －７０℃ 以下 ， 但应避免反 复冻融 （ 冻融不超过三次 ）。 ６ 　 操作方法 ６ ． １ 　 实验室要求 水泡性口炎病毒荧光 ＲＴＰＣＲ 检测的实验室分为三个相对独立的工作区域 ： 样本制备区 、 反应混 合物配制区和检测区 ； 各工作区域应有明确标记 ， 避免不同工作区域内的设备 、 物品混用 ； 每一区域应有 专用的仪器设备 ； 进入各个工作区域应严格遵循单一方向顺序 ， 即只能从样本制备区 、 扩增反应混合物 配制区至检测区 。 ６ ． ２ 　 样本的处理 ６ ． ２ ． １ 　 在样本制备区进行 。 样品中总 ＲＮＡ 提取的试剂盒 ， 有商品化试剂盒出售 ， 也可自行配制 。 ６ ． ２ ． ２ 　 取 狀 个灭菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 ， 其中 狀 为被检样品 、 阳性对照与阴性对照的数量之和 （ 阳 性对照 、 阴性对照在试剂盒中已标出 ）， 编号 。 ６ ． ２ ． ３ 　 每管加入 ６００ μ Ｌ 裂解液 ， 分别加入被检样本 、 阴性对照 、 阳性对照各 ２００ μ Ｌ ， 一份样本换用一 个吸头 ， 再加入 ２００ μ Ｌ 三氯甲烷 ， 在混匀器上振荡混匀 ５ｓ （ 不能过于强烈 ， 以免产生乳化层 ， 也可以用 手颠倒混匀 ）。 于 ４℃ 以 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ｍｉｎ 。 ６ ． ２ ． ４ 　 取与 ６．２．２ 相同数量灭菌的 １．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ 管 ， 加入 ５００ μ Ｌ 异丙醇 （ －２０℃ 预冷 ）， 做标记 。 吸取 ６．２．３ 各管中的上清液转移至相应的管中 ， 上清液应至少吸取 ５００ μ Ｌ ，