ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T26618—2011 派 琴虫病诊断操作规程 ProtocolofdiagnosisforPerkinsosis 2011-06-16发布 2011-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A为规范性附录,附录B和附录C为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、福建出入境检验检疫局、黄岛出入境检验检疫局、国家 海洋环境监测中心、深圳出入境检验检疫局、上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:吴绍强、林祥梅、刘建、郑腾、李西峰、梁玉波、刘荭、李建、韩雪清、贾广乐、梅琳。 ⅠGB/T26618—2011 引 言 派琴虫病是影响世界贝类养殖业发展的主要寄生虫病,为国际兽医局(OIE)规定的必报水生动物 疫病之一。本病1946年首次报道,当时,引起美国路易斯安那州的墨西哥海湾的大批牡蛎(Crassostrea virginica)死亡。迄今为止,已发现派琴虫存在于美洲、欧洲、澳洲、亚洲和非洲五大洲的许多贝类体内, 包括牡蛎、鲍鱼、蛤子、扇贝、珍珠牡蛎、鸟蛤和贻贝等体内,并在许多地区造成了严重的危害,死亡率高 达95%。 1997年,我国在栉孔扇贝、虾夷扇贝、皱纹盘鲍、菲律宾蛤仔体内检测到派琴虫。美国2005年也从 中国广西北海进口牡蛎中检出派琴虫。目前,派琴虫已经成为影响我国贝类养殖业发展的主要病原之 一。据对黄海北部三个海域的菲律宾蛤仔的派琴虫感染状况进行调查的结果表明,除3月份和6月份 的感染率分别为95%和90%之外,其他月份感染率均为100%。 目前,派琴虫感染的诊断通常依靠OIE推荐的组织切片法、FTM组织培养法以及PCR方法。组 织学方法可以通过显微镜下直接观察虫体或观察组织损伤来监测感染的分布情况。FTM培养派琴虫 休眠孢子的方法是将派琴虫滋养体进行培养,培养后,虫体体积增大、细胞壁增厚,而且不繁殖,是一种 传统有效的定量检测派琴虫的方法。实时荧光PCR检测贝类派琴虫的方法敏感度较高,而且特异性 强,检测可在一天之内完成,定量准确、全封闭反应等优点。 ⅡGB/T26618—2011 派琴虫病诊断操作规程 1 范围 本标准规定了派琴虫病诊断时的样品采集,虫体培养及显微镜检查,PCR以及荧光PCR检测操作 规程。 本标准适用于蛤仔、牡蛎等水生动物及其产品中携带海洋派琴虫(Perkinsusmarinus)、奥尔森派 琴虫(Perkinsusolseni)等派琴虫的诊断,也可用于派琴虫病的监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 派琴虫病 Perkinsosis 帕金虫病 由海洋派琴虫(P.marinus)、奥尔森派琴虫(P.olseni)等在宿主血细胞内寄生或者游离在结缔组 织、鳃、内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病。 注:除P.marinus、P.olseni之外,病原还包括P.qugwadi、P.chesapeaki、P.andrewsi和P.mediterraneus。 3.2 Ct值 cyclethreshold 荧光PCR反应中,荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数。 4 材料 除另有规定外,所用化学试剂均为分析纯。 试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求。 4.1 液体巯基乙酸盐培养基(fluidthioglycollatemedia,FTM):具体配制方法见附录A。 4.2 卢戈氏碘液(Lugol’siodine):配制方法见附录A。 4.3 2.5%氯霉素:配制方法见附录A。 4.4 1%制霉菌素:配制方法见附录A。 4.5 酚-三氯甲烷抽提法所需要的相关试剂或其他DNA抽提试剂盒,见附录A。 4.6 10×PCRbuffer、25mmol/LMgCl2、dNTP(2.5mmol/L或10mmol/L)、5U/μLrTaqDNA聚 合酶等,均为商品化试剂盒中成分。 4.7 琼脂糖。 4.8 电泳缓冲液:配制方法见附录A。 4.9 引物及探针:包括PCR引物及荧光PCR引物和探针。 1GB/T26618—2011 5 设备 5.1 低温培养箱:能够进行22℃~24℃培养。 5.2 生物显微镜。 5.3 -20℃普通冰箱、-70℃的超低温冰箱、4℃冰箱。 5.4 组织研磨器。 5.5 高速冷冻离心机。 5.6 PCR扩增仪。 5.7 荧光PCR扩增仪。 5.8 电泳仪。 5.9 凝胶成像仪或紫外透射仪。 5.10 水浴锅。 6 派琴虫的检测方法 6.1 采样 6.1.1 采样点的选择 按照GB/T18088规定方法进行。应根据实际情况,一个区域的一个种群至少选取3个采样点,大 范围的几块不连续地区或者养殖易感品种的区域,应增加采样点。 6.1.2 采样技术要求 6.1.2.1 有临床症状的贝类 牡蛎感染派琴虫的症状表现为消化腺发白,贝壳不能闭合,套膜收缩,性腺发育受到抑制、偶尔也会 出现脓肿,身体严重衰弱,生长迟缓等。采样时,至少挑选10条濒死的或可疑的个体。采样时贝类应当 是活的,贝类应当在活体或杀死后分别包装放在冷藏的容器中送到实验室。所采集的贝类样品应避免 冰冻。主要采集贝类的鳃、套膜、消化腺、闭合肌等。 6.1.2.2 无临床症状的贝类 当养殖场的个体有怀卵时,应每年在产卵期采集一次精液或卵液。如怀卵群体由不同年龄的贝类 个体组成,应选取两岁龄的贝类采样。样品应包括该地所有的易感品种。每次采样的贝类数量要以感 染率等于或大于2%时检出的概率进行抽样。通常情况是至少采集150个贝类。 对无临床症状的贝类,取其鳃、套膜、消化腺、闭合肌等。 6.1.2.3 监测目的的采样 监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能检测到该虫的季节。采样数量参见6.1.2.2。 6.1.2.4 样品保存及运送 采取的样品应在取样后24h内,冷藏送入实验室,要附有标签,清楚标明采样地点、来源和养殖历 史,实验室内冷藏保存备检。 6.2 虫体培养 6.2.1 样品的选择 选取垂死的新鲜贝类样品。 6.2.2 样品前处理 将贝壳弃掉,置于灭菌的研钵,剪刀剪至1mm~3mm大小。 6.2.3 样品的培养 将样品分别置于含5mLFTM培养基的灭菌试管中,加250μL2.5%的氯霉素摇匀,用1mL1% 制霉菌素覆盖在液面,盖好盖子,22℃~24℃低温培养箱中暗室培养4d~7d。 2GB/T26618—2011 6.2.4 样品的纯化 将培养后的样品4000r/min离心10min,弃上清液,加6mL2mol/LNaOH,涡旋混匀后置于 60℃烘箱内消化过夜。4000r/min离心10min,弃上清液,加2mLddH2O洗涤,4000r/min离心 10min,弃上清液,重复上述步骤2次~4次。 6.2.5 染色镜检 将纯化的样品置于2mLddH2O中摇匀,加入80μL卢戈氏碘液染色后,取40μL于载玻片上,盖 上盖玻片后,在显微镜(10×10)下顺序观察。 6.2.6 结果判断 显微镜下,经过FTM培养后,派琴虫发育为休眠孢子,呈圆形,蓝黑色,直径大多在30μm~ 80μm。形态参见附录B。 6.3 PCR检测 6.3.1 材料 选取活的或刚死的贝类的鳃组织,也可采用乙醇或者低温保存的贝类鳃组织样品。 6.3.2 操作步骤 6.3.2.1 DNA的提取 取25mg样品,剪碎后见附录A中提取组织DNA的方法提取基因组DNA,也可采用商品化的组 织基因组DNA提取试剂盒进行。除检测样品外,需要设立如下对照: ———取已知感染派琴虫的贝类组织作为阳性对照; ———取未患病的贝类组织作为阴性对照; ———空白对照。 6.3.2.2 引物 上游引物:5′-CCGCTTTGTTTGGMTCCC-3′ 下游引物:5′-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3′ PCR预期扩增派琴虫属的ITS区域片段长度为666bp~672bp(具体序列参见附录C),引物合成 后均采用灭菌ddH2O均稀释为10μmol/L,-20℃保存备用。 6.3.2.3 反应体系 在PCR管内,加入10×PCRbuffer2.5μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL、10μmol/L上下游 引物各0.5μL、2.5mmol/LdNTP2μL、模板DNA10μL、补充ddH2O至25μL。 PCR操作时,取等体积的ddH2O代替DNA模板作为空白对照。 6.3.2.4 扩增程序 95℃预变性4min;之后95℃变性1min,53℃退火1min,65℃延伸3min,共40个循环;最后 65℃补充延伸5min。 6.3.2.5 琼脂糖电泳 取5μLPCR扩增产物,在1×电泳缓冲液内进行1%~2%的琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后,用紫外 灯或凝胶成像仪观察是否扩增出预期大小的特异性DNA片段。 6.3.3 结果判定 6.3.3.1 试验成立的条件 阳性对照有预期大小的扩增条带,阴性对照及空白对照没有相应片段的PCR产物。否则试验 无效。 6.3.3.2 样