ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27530—2011 牛 出血性败血病诊断技术 Diagnostictechniquesforbovinehaemorrhagicsepticaemia 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A、附录B和附录C为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:甘肃农业大学。 本标准主要起草人:胡永浩、包世俊、伏小平、曾巧英、温峰琴、杨学山、邢小勇、郝宝成、项海涛。 ⅠGB/T27530—2011 牛出血性败血病诊断技术 1 范围 本标准规定了牛出血性败血病(bovinehaemorrhagicsepticaemia,HS)的临床与病理学诊断及病原 学诊断的方法和技术要求。 本标准适用于口岸、产地及集散地牛出血性败血病的诊断、检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.28—2003 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 AGID:琼脂凝胶扩散试验(agargelimmunodiffusiontest) CIEP:对流免疫电泳试验(counterimmunoelectrophoresistest) CSY:酪蛋白-蔗糖-酵母琼脂(casein/sucrose/yeastagar) HS:出血性败血病(haemorrhagicsepticaemia) IHA:间接血凝试验(indirecthaemagglutinationtest) PB:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer) RBCs:红细胞(redbloodcells) 4 临床与病理学诊断 4.1 流行特征 黄牛、水牛、牦牛和奶牛均可感染发病。患病动物、带菌动物为传染来源。有时,健康畜禽的口腔、 扁桃体和上呼吸道带菌。畜群中发生巴氏杆菌病而查不出传染源时,一般认为家畜在发病前已经带菌。 病畜由其排泄物、分泌物排出有毒力的病菌,污染饲料、饮水、用具和外界环境,经消化道而传染给健康 家畜。或由咳嗽、喷嚏排出病菌,通过飞沫经呼吸道发生传染。也可通过有伤口的皮肤、黏膜发生传染。 吸血昆虫叮咬也可传播病菌。 本病的发生一般无明显的季节性。通常呈散发性流行,在畜群中少数几头动物先后发病。水牛、牦 牛有时可呈地方性流行。发病率、病死率均高。寒冷、闷热、潮湿、拥挤、气候剧变、阴雨连绵、圈舍通风 不良、营养缺乏、饲料突变、过度疲劳、长途运输以及其他疾病、感染等是诱发因素。 4.2 临床症状 4.2.1 败血型:病牛病初体温高达41℃~42℃,呼吸及心跳加快,鼻镜干裂,皮温不整,食欲减退甚至 废绝。病初便秘,后腹泻,粪便始呈粥样,后为液状并混有黏液、黏膜片及血液,恶臭。有时出现鼻漏和 血尿。腹泻开始后体温下降,不久即死亡。病程多为12h~24h。 4.2.2 浮肿型:除呈现体温升高等一般性全身症状外,病牛颈部、咽喉部及胸前部皮下出现迅速扩展的 炎性水肿,同时伴有舌及周围组织的高度肿胀,舌多伸出齿外,呈暗红色。呼吸高度困难,皮肤和黏膜发 绀,常因窒息或下痢而死。病程多为12h~36h。 1GB/T27530—2011 4.2.3 肺炎型:除呈现体温升高等一般性全身症状外,病牛主要表现为急性纤维素性胸膜肺炎的症状。 体温升高,呼吸困难,干咳,流泡沫样鼻液,后鼻液呈脓性。胸部叩诊有痛感。病初便秘,后腹泻,粪便恶 臭并混有血液。病程一般3d~7d左右。 4.3 病理剖检 4.3.1 败血型:皮下、各部位黏膜、浆膜、肌肉等均有出血点。胸腹腔有大量渗出液。真胃、小肠及大肠 常见出血性炎症,肠内容物稀薄且多混有血液。淋巴结显著水肿。脾点状出血但不肿大。肺淤血、 水肿。 4.3.2 浮肿型:咽喉部、颈部及肢体部皮下水肿,切开水肿部位流出深黄色透明液体,间或杂有出血。 咽周围组织及会厌软骨韧带呈黄色胶样浸润,咽淋巴结和前颈淋巴结肿胀。上呼吸道黏膜卡他性炎症。 4.3.3 肺炎型:胸腔中有大量浆液性纤维素性渗出液,肺脏和胸膜表面有小出血点并覆有纤维素膜,肺 脏切面呈大理石状。心包与胸膜粘连,内有干酪样坏死物。胃肠道急性卡他性炎症和出血性炎症。淋 巴结肿大,呈紫色,布满出血点,尤以支气管淋巴结与纵膈淋巴结最为明显。 4.3.4 依据流行特征、临床症状以及病理变化可作出初步诊断,确诊要进行病原学诊断。 5 病原学诊断 5.1 病料采集及处理 无菌采集病死动物的体腔渗出液、血液、肝脏、脾脏、淋巴结等新鲜病料,及时送检或置冷暗处保存 备用。死亡时间较长的病例可采集长骨骨髓作为病料。可现场制作病料涂片或触片,供染色镜检。 5.2 染色镜检 采集病料涂片或触片,染色后置显微镜下观察。革兰氏染色(按GB/T4789.28—2003中2.2规定 操作)可见革兰氏阴性的短杆菌或球杆菌,菌体大小为(0.2μm~0.4μm)×(0.6μm~2.5μm)。瑞氏 染色(按GB/T4789.28—2003中2.6规定操作)和美蓝染色(按GB/T4789.28—2003中2.1规定操 作)时菌体两极浓染,印度墨汁染色(见附录A)可见明显的荚膜。 慢性病例或腐败材料常不易发现典型细菌,应该经分离培养后再行染色镜检。 镜检观察到典型菌体,结合流行特点、症状和病变,可初步诊断为本病。进一步进行病原分离鉴定 以作出确切诊断。 5.3 病原分离鉴定 5.3.1 病原分离 病料分别接种麦康凯琼脂培养基(见附录B)、酪蛋白-蔗糖-酵母(CSY)琼脂培养基(见附录B)和鲜 血琼脂培养基(见附录B),置37℃条件下培养18h~24h后,挑选可疑菌落进行鉴定。当病料中细菌 含量小时,可用5%血清肉汤(按照GB/T4789.28—2003)于37℃进行增菌培养。 5.3.2 病原鉴定 5.3.2.1 培养特性 多杀性巴氏杆菌在麦康凯琼脂培养基上不生长。在血液琼脂培养基上经18h~24h后可长成圆 形、光滑、湿润、有灰白色光泽的半透明菌落,直径约1mm,菌落周围无溶血现象。在CSY琼脂培养基 上菌落通常大于血液琼脂培养基上的菌落。老龄培养物,特别是在无血培养基上的老龄培养物,形成的 菌落小于血液琼脂培养基上的菌落。 5.3.2.2 菌体形态 取血液琼脂培养基上生长18h~24h的典型菌落涂片,革兰氏染色镜检可见革兰氏阴性的球杆菌, 菌体大小为(0.2μm~0.4μm)×(0.6μm~2.5μm)。 5.3.2.3 生化试验 5.3.2.3.1 取纯培养的待检菌少许接种发酵管(见附录B),置37℃培养,每天观察并记录结果。多杀 性巴氏杆菌可分解葡萄糖、果糖、半乳糖、单奶糖、蔗糖和甘露糖,产酸不产气;不发酵棉子糖、乳糖、鼠李 2GB/T27530—2011 糖、菊糖、水杨苷、肌醇。 5.3.2.3.2 MR、VP试验(按GB/T4789.28—2003中3.4规定操作)阴性。 5.3.2.3.3 吲哚试验(按GB/T4789.28—2003中3.13规定操作)阳性。 5.3.2.3.4 氧化酶试验(按GB/T4789.28—2003中3.18规定操作)、过氧化氢酶试验(按GB/T4789.28— 2003中3.20规定操作)阳性,β-半乳糖苷酶试验(按GB/T4789.28—2003中3.3规定操作)、脲酶试验 (按GB/T4789.28—2003中3.15规定操作)阴性。 5.3.2.3.5 硝酸盐还原试验(按GB/T4789.28—2003中3.17规定操作)阳性,柠檬酸盐利用试验(按 GB/T4789.28—2003中3.5规定操作)阴性。 5.3.2.3.6 硫化氢试验(按GB/T4789.28—2003中3.14规定操作)阴性,明胶液化试验(按 GB/T4789.28—2003中3.10规定操作)阴性。 5.3.2.3.7 依据病原培养特性、菌体形态、生化试验,符合多杀性巴氏杆菌特征者可作出确定诊断。必 要时进行血清分型试验和动物接种试验。 5.3.2.4 血清分型试验 5.3.2.4.1 间接血凝试验 5.3.2.4.1.1 材料 所用材料如下所示: a) 标准菌及待检菌荚膜抗原(见附录C)。 b) 特异性抗血清(见附录C)。 c) 1%新鲜绵羊红细胞(见附录C)。 d) 致敏绵羊红细胞(见附录C)。 e) 阿氏液(Alsever’s液)(见附录A)。 f) 80孔血凝反应板(大孔板)。 5.3.2.4.1.2 方法 间接血凝试验方法步骤如下所示: a) 反应板每排第1孔加入0.85%NaCl溶液0.72mL,自第2孔起各孔分别加入0.85%NaCl 溶液0.4mL。 b) 各型特异性抗血清各自单独一排稀释,第1孔加入血清0.08mL,混匀,移取0.4mL到下一 孔。同样方法稀释至第7孔。 c) 每孔加入0.4mL致敏绵羊红细胞。 d) 同时设如下对照: ———血清对照:血清(10倍稀释)0.4mL+加1%新鲜绵羊红细胞0.4mL。 ———绵羊红细胞对照:1%新鲜绵羊红细胞0.4mL+0.85%NaCl溶液0.4mL。 ———抗原对照:1%致敏绵羊红细胞0.4mL+0.85%NaCl溶液0.4mL。 ———反应程序见表1。