ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27540—2011 猪 瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionof classicalswinefevervirus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人:王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。 ⅠGB/T27540—2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于猪瘟的诊断和监测,适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核 酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CSFV:猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus) Ct值:达到阈值的循环数(cyclethreshold) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) HSTaq酶:热启动TaqDNA聚合酶(HSTaqDNApolymerase) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) 荧光RT-PCR:荧光逆转录聚合酶链式反应(realtimefluorescentquantitativereverse transcriptionpolymerasechainreaction) 4 试剂和材料 除另有说明,所用试剂均为分析纯;所有试剂均用无RNA酶的容器分装。 4.1 Trizol:RNA抽提试剂,外观为粉红色,分装至棕色瓶中,于4℃~8℃保存。 4.2 氯仿:4℃预冷。 4.3 异丙醇:4℃预冷。 4.4 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,-20℃预冷。 4.5 DEPC水:去离子水中加入0.1%DEPC,37℃作用1h,(121±2)℃,高压灭菌15min。 4.6 RNA酶抑制剂(30U/μL)。 4.7 10×PCRbuffer(10mmol/LpH8.3Tris-HCl,50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2)。 4.8 dNTP(2.5mmol/L)。 4.9 用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,其序列如下: 上游引物F:5-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA-3 1GB/T27540—2011 下游引物R:5-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3 探针P:5-FAM-CCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGA-TAMRA-3 4.10 反转录酶:SuperscriptⅢ反转录酶(200U/μL)。 4.11 DNA聚合酶:HSTaqDNA聚合酶(5U/μL)。 4.12 阴性对照:DEPC水。 4.13 强阳性对照:非感染体外转录RNA(4200pg/μL)。 4.14 弱阳性对照:非感染体外转录RNA(42pg/μL)。 5 器材和设备 5.1 高速台式冷冻离心机:最大离心力12000g以上。 5.2 冰箱。 5.3 荧光PCR检测仪。 5.4 组织匀浆器。 5.5 微量移液器和吸头。 5.6 离心管。 6 样品的采集 6.1 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,样本不得交叉污染。 6.2 采样工具 扁桃体采样器:鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3%氢氧化钠溶液浸泡消毒5min~10min, 经清水冲洗。 灭菌牙签和0.5mL或1.5mL离心管经(121±2)℃,高压灭菌15min;剪、镊经160℃干烤2h。 6.3 采样方法 6.3.1 活体样品 固定活猪的上唇,用开口器打开口腔,用采样枪采取扁桃体样品,用灭菌牙签挑至0.5mL或1.5mL 离心管并作标记,编号,送实验室。取待检样品,按1∶5倍体积加入DEPC水,于研钵或组织匀浆器中 充分研磨,3000g离心15min,取上清液转入离心管中编号备用。 6.3.2 内脏样品 采取病死猪各种脏器(淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装入一次性塑料袋或其他灭菌容器, 编号,送实验室。取50mg~100mg待检样品,按1∶5倍体积加入DEPC水,于研钵或组织匀浆器中 充分研磨,3000g离心15min,取上清液转入离心管中编号备用。 6.3.3 4%EDTA抗凝血 用无菌注射器直接全血,注入含1/104%EDTA溶液的无菌容器中,充分混匀后编号备用。 2GB/T27540—2011 6.3.4 排泄物 挑取少许粪便样本于离心管中,加入适量生理盐水,振荡混匀,室温3000g离心15min,取上清液 转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转入离心管编号备用。 6.3.5 细胞培养物 细胞培养物冻融3次,转入离心管中编号备用。 6.4 存放与运送 采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置-70℃冰箱,但 应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,在6h~8h 之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。 7 实时荧光RT-PCR检测 7.1 核酸提取 在样本制备区进行。 7.1.1 取n个灭菌的1.5mL离心管,其中n为待检样品数×重复数3+阳性管数+弱阳性管数+阴 性管数,对每个离心管进行编号。 7.1.2 每管加入500μLTrizol,分别加入被检样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照各200μL(由于 阳性和弱阳性样品中模板浓度相对较高,检测过程中不得交叉污染),颠倒10次混匀,静置5min;再加 入200μL氯仿,混匀器上振荡混匀5s(也可以用手反复颠倒混匀)。于4℃、12000g离心15min。 7.1.3 取与7.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管,加入500μL异丙醇(4℃预冷),对每个管进行 编号。取7.1.2中离心后的上清液约500μL(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中,颠倒混匀, -20℃静置30min。 7.1.4 于4℃、12000g离心15min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置),弃上清,倒置于吸水纸 上,沾干液体,加入600μL75%乙醇,颠倒洗涤。 7.1.5 于4℃、12000g离心10min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置),弃上清,倒置于吸水纸 上,沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。 7.1.6 4000g离心10s(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置),用微量加样器小心将残余液体吸 干,室温干燥3min~10min。 7.1.7 加入38μL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂,轻柔混匀,溶解管壁上的RNA,冰上保 存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增;若需长期保存应放置-70℃冰箱。 7.2 荧光RT-PCR扩增体系的配制 在反应混合物配制区进行。 设PCR反应数为n,其中n为待检样品数×重复数3+阳性管数+弱阳性管数+阴性管数,每个样 本测试反应体系配制见表1。配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气泡,上机前注意检查各反应 管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器。 3GB/T27540—2011 表1 每个样品反应体系配制表 体系组分 用量 终浓度 猪瘟病毒RT-PCR反应液10×PCRBuffer 5.0μL 1× dNTPs 1.5μL 0.075μmol/L 上游引物F 3.0μL 0.6μmol/L 下游引物R 3.0μL 0.6μmol/L 探针溶液 探针P 1.5μL 0.15μmol/L 反应酶SuperscriptⅢ反转录酶 0.3μL 2U/μL HSTaqDNA聚合酶 0.5μL 0.05U/μL 总 量 14.8μL 7.3 加样 在样本处理区进行。 在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入本标准7.1.7中制备的35.2μLRNA溶液,盖紧管盖后, 500r/min离心30s。放入荧光PCR检测仪内。 7.4 荧光RT-PCR扩增 在检测区进行。 将本标准7.3中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内,记录样品摆放顺序。 循环条件设置: a) 反转录50℃/20min; b) 预变性94℃/4min; c) 88℃、8s,60℃、35s,40个循环。荧光收集设置在此阶段每次循环的退火延伸时进行。 7.5 结果判定 7.5.1 阈值设定 试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果,Ct值为每个反应管内的荧光信 号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过 正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 7.5.2 质控标准 7.5.2.1 阴性对照无Ct值,且无典型扩增曲线。 7.5.2.2 强阳性对照的Ct值应<27.0并出现典型的扩增曲线;弱阳性对照的Ct值应在34.0左右并 出现典型的扩增曲线。否则,此次试验视为无效。 7