ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28065—2011 地 中海实蝇生物芯片检测方法 BiochipdetectionofCeratitiscapitata(Wiedemann) 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局, 本元正阳基因有限公司、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:余道坚、李建光、任鲁风、徐浪、周琦、章桂明、陈枝楠、汪万春、康林、仲建忠、 向才玉。 ⅠGB/T28065—2011 地中海实蝇生物芯片检测方法 1 范围 本标准确定了地中海实蝇Ceratitiscapitata(Wiedemann)(双翅目Diptera实蝇科Tephritidae) 的生物芯片制备、检测和结果判定方法。 本标准适用于相关贸易和有害生物监测中地中海实蝇卵、幼虫、蛹的鉴定和成虫的鉴定或复核。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2039 地中海实蝇检疫鉴定方法PCR法 3 缩略语 SN/T2039界定的缩略语适用于本文件。 4 方法原理 选择实蝇科昆虫线粒体DNACOI基因核苷酸片段为分子标记探针,将探针按预先设置的排列固 定于特定的固相支持载体(如:醛基化基片)的表面形成微点阵,利用反向固相杂交技术,用Cy3标记脱 氧胞苷三磷酸(Cy3-dCTP)荧光标记的样品分子与微点阵上的探针杂交,实现多个分子之间的杂交反 应,并通过芯片扫描信号的判读来检测样品中特定基因片段的存在,最后确定是否为地中海实蝇。 5 仪器和用具 PCR扩增仪、芯片点样仪、芯片扫描仪、离心机、水浴锅、涡旋器、冰箱、电子天平、烘箱、磁力搅 拌器。 醛基化基片、多孔板、芯片盖片、芯片分隔围栏、芯片粘贴工具、湿盒、杂交盒、计时器、磁柱、芯片架、 2L烧杯、15mL离心管、量筒、移液器等。 6 试剂 6.1 昆虫基因组DNA提取试剂盒。 6.2 DNA快速纯化/回收试剂盒。 6.3 去离子水。 6.4 50%二甲基亚砜(DMSO)。 6.5 0.2%十二烷基磺酸钠(SDS)。 6.6 0.2%硼氢化钠。 1GB/T28065—2011 6.7 10×SSPE(20×SSPE:3mol/L氯化钠,200mmol/L磷酸二氢钠,25mmol/LEDTA,pH7.4)。 6.8 0.3×SSC、0.06×SSC(20×SSC:3mol/L氯化钠,300mmol/L柠檬酸钠)。 6.9 10×PCR缓冲液(Mg2+,15mmol/L)。 6.10 dATP,dTTP,dCTP,dGTP(10pmol/μL)。 6.11 Cy3-dCTP。 6.12 Taq酶。 6.13 引物(10pmol/μL)。 6.14 探针(50μmol/L)。 6.15 阳性质粒。 6.16 乙醇(70%和99.9%)。 6.17 洗液Ⅰ(0.3×SSC,0.2%SDS)。 6.18 洗液Ⅱ(0.06×SSC)。 7 生物芯片检测方法 7.1 样品前处理 按照SN/T2039进行。 7.2 基因组DNA制备 按照SN/T2039进行。 7.3 生物芯片探针 7.3.1 检测探针 检测探针包括以下类型的探针(见A.1): ———实蝇科通用探针; ———地中海实蝇与纳塔尔实蝇近缘种特异探针; ———地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种特异探针; ———地中海实蝇种特异探针; ———纳塔尔实蝇C.rosa种特异探针; ———非洲芒果实蝇C.cosyra种特异探针。 注1:检测探针是一条20nt~29nt的寡核苷酸;序列为实蝇科昆虫的特异性序列,5’端氨基修饰。 注2:实蝇科通用探针能够特异检测实蝇科昆虫,近缘种探针能够特异检测相应的两个近缘种,地中海实蝇、纳塔尔 实蝇和非洲芒果实蝇种特异性探针分别可特异检测上述三种实蝇。 7.3.2 质控探针 质控探针包括以下四种类型探针(见A.2): ———定位点探针; ———阳性对照探针; ———阴性对照探针; ———空白对照。 7.4 芯片制备 7.4.1 芯片基片:选择光学级醛基基片。 2GB/T28065—2011 7.4.2 探针稀释:探针用50%DMSO溶解至终浓度为50μmol/L,按照探针点阵排布顺序,将探针溶 液用移液器加入多孔板中。 7.4.3 点样:用芯片点样仪将探针点至基片上。实蝇芯片探针阵列排布图参见B.1。一张基片四个探 针点阵的示意图参见B.2。 注:每个阵列共5行10列,第1行和第1列为定位点探针,其他探针各设三个重复。每张基片可以根据实际需求点 1个或多个相同探针点阵。 7.4.4 水合:基片置湿盒(内盛三分之一体积水),在烘箱37℃水合12h。 7.4.5 固定:将基片放在芯片架上,置盛有0.2%SDS溶液的烧杯中磁力搅拌漂洗5min。取出再放入 盛有去离子水的烧杯中磁力搅拌漂洗3次,每次2min。 注:漂洗时溶液应没过基片,洗涤时应在洗液中加入磁柱,打开磁力搅拌器搅拌;每漂洗一次,更换去离子水。 7.4.6 封闭:将固定的基片放入盛有0.2%NaBH4封闭液的烧杯中先磁力搅拌漂洗5min,关闭磁力 搅拌器,静置5min,再磁力搅拌漂洗5min;最后用去离子水磁力搅拌漂洗3次,每次2min。 7.4.7 质检:基片置15mL离心管中,2000r/min离心2min除去水分;用芯片扫锚仪对基片进行预 扫描质检,质检合格后芯片避光冷藏保存。 注:基片表面无残余固定剂,探针阵列完整,定位点清晰的为合格的芯片。 7.5 荧光标记PCR 荧光标记PCR反应在常规PCR仪上进行,引物P3和P5序列见C.1,标记PCR反应体系见C.2。 扩增条件:94℃90s;94℃30s、55℃30s、72℃30s,30个循环;72℃5min。待测样品模板DNA和 实蝇阳性质粒平行进行荧光标记PCR,阳性质粒基因序列见C.3。 注:阳性质粒是一段人工合成的DNA片段,其5’端和3’端核苷酸序列分别为引物P3和P5的互补链。 7.6 杂交反应 7.6.1 杂交液预热 10×SSPE芯片杂交液在水浴锅中预热至50℃。 7.6.2 变性 分别取杂交液10μL和PCR产物10μL(实蝇模板扩增产物8μL和阳性质粒扩增产物2μL)到一 个灭菌的50μL离心管中,涡旋混匀,在PCR仪上95℃变性5min。 7.6.3 杂交 盖上芯片盖片,取变性后的产物20μL加入点样区,芯片用锡箔纸包装,置湿盒中在烘箱46℃避光 杂交3h。 7.6.4 清洗 杂交后的芯片依次在42℃预热的洗液Ⅰ、洗液Ⅱ中磁力搅拌清洗2min。 7.6.5 离心 芯片置15mL离心管中,2000r/min离心2min除去水分。 7.7 芯片扫描 杂交后的芯片用芯片扫描仪在远红外光区532nm处进行扫描,PMT值设为800。通过扫描仪软 件获得所有探针阵列的荧光数据。 注:芯片扫描结果存入计算机,扫描后芯片避光室温保存。 3GB/T28065—2011 7.8 结果判读 芯片杂交信号判读原则见附录D。在质控探针和定位点探针杂交信号正常的情况下,检测探针杂 交信号满足以下情况判定为地中海实蝇: ———实蝇科探针(teph)杂交信号阳性; ———地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种探针(caro)杂交信号阳性; ———地中海实蝇和纳塔尔实蝇近缘种探针(caco)杂交信号阳性; ———地中海实蝇特异探针(ccca)杂交信号阳性。 4GB/T28065—2011 附 录 A (规范性附录) 地中海实蝇生物芯片检测探针、质控探针及探针阵列 A.1 地中海实蝇生物芯片检测探针见表A.1。 表A.1 地中海实蝇生物芯片检测探针 探针类型 探针名称 探针序列(5’-3’) 特异性说明 科通用探针 teph AGCAAAGACTGCTCCTATTGATAAT 实蝇科通用探针 近缘种特异探针caco ATAGCTGGGGAATAATTTAATTG地中海实蝇和非洲芒果实蝇 近缘种探针 近缘种特异探针caro CGTTAAACCTCCAACTGTAAA地中海实蝇和纳塔尔实蝇 近缘种探针 种特异探针 ccca AGAACAACGCCCGTTAAACC 地中海实蝇特异探针 种特异探针 ccco CTGTTAAACCCCCAACTGTGA 非洲芒果实蝇特异探针 种特异探针 cpro ACATAATGGAAGTGTGCTACAAC 纳塔尔实蝇特异探针 A.2 地中海实蝇生物芯片检测质控探针见表A.2。 表A.2 地中海实蝇生物芯片检测质控探针 类型 代码 序列(5’-3’)长度 nt 定位点探针 A TGGATACCCAACTTAGCTATTAATAGTC 28 阳性对照探针 P TGAGACCAACCAACTGAAACG 21 阴性对照探针 N GACTATAGTATAAGCGCGGTCCA 23 空白对照aB — — a空白对照为水对照。 5GB/T28065—2011 附 录 B (资料性附录) 芯片检测探针点阵图及在基片上布局示意图 B.1 地中海实蝇芯片检测探针阵列示意图见图B.1。 A A A A A A A A A A A tephtephteph A cacocacoca