ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28089—2011 葱 类黑粉病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofUrocystiscepulaeFrost 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫 局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:邵秀玲、赵汗青、王英超、种焱、吴兴海、张治宇、江丽辉、高文娜、张京萱、宋涛、 罗志萍。 ⅠGB/T28089—2011 葱类黑粉病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了葱类黑粉病菌检疫鉴定方法。 本标准适用于洋葱等葱属中葱类黑粉病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T18085 植物检疫 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 SN/T1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T1809 进出口植物种子检疫规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 孢子球 sporeballs 由一至多数冬孢子集结而成,易分开成单独的冬孢子或坚固而不易分离,外层有浅色的较小的不孕 细胞包围。 4 葱类黑粉病菌基本信息 中文名:葱类黑粉病菌。 学名:UrocystiscepulaeFrost1877 异名:Tuburciniacepulae(Frost)Liro1922,Tuburciniamagica(Pass.)Liro1922,Urocystis colchicivar.cepulaeCooke1877,UrocystismagicaPass.1875。 病害英文名:onionsmut。 属真菌界Fungi,担子菌亚门Basidiomycotina,黑粉菌纲Ustilaginomycetes,条黑粉菌目Urocys- tales,条黑粉菌科Urocystaceae,条黑粉菌属Urocystis。 葱类黑粉病菌的其他信息参见附录A。 5 方法原理 经现场查验,实验室分离培养,根据病原菌的形态特征、生物学特性,结合寄主范围进行结果判定。 6 仪器和用具 6.1 生物显微镜(具油镜镜头,具测量功能)、具透射光源的体视显微镜(放大倍数不低于50×)。 1GB/T28089—2011 6.2 超净工作台。 6.3 电子天平。 6.4 光照恒温培养箱。 6.5 酒精灯。 6.6 高压灭菌器。 6.7 培养皿。 6.8 医用手术剪、镊子。 6.9 烧杯(500mL)。 6.10 试管(直径12mm)。 6.11 载玻片、盖玻片。 6.12 量筒(500mL)。 6.13 微量可调加样器(5μL~20μL)。 6.14 刻度离心管:10mL或20mL。 6.15 加样器枪头(2μL~20μL)。 6.16 三角瓶(250mL)。 6.17 席尔氏浮载剂(见GB/T18085)。 6.18 干热灭菌器。 6.19 往复式振荡器。 6.20 涡旋振荡器。 7 主要试剂 7.1 蒸馏水。 7.2 吐温-20。 7.3 1%的次氯酸钠溶液。 7.4 洋葱琼脂培养基。 8 现场检测 8.1 抽样方法 棋盘式、五点式或随机抽样。 8.2 抽样数量 8.2.1 种子 对来自葱类黑粉病菌发生国家和地区(参见附录A)的洋葱等种子按SN/T1809进行抽样。 8.2.2 洋葱、大蒜等鳞茎 对洋葱、大蒜等鳞茎按SN/T1157进行抽样。 8.3 症状检查 对洋葱、大蒜等鳞茎,注意检查鳞茎上是否有典型的黑粉症状,挑选个头小(孢子在鳞茎上产生可能 引起鳞茎变小)、干腐的鳞茎,洋葱鳞茎常形成铅色到黑色的条斑;洋葱叶片上形成铅色到黑色的轻微变 2GB/T28089—2011 厚的条斑或水泡,当增厚区域较大时可引起子叶向下弯曲。随着叶片基部病斑的扩大,病斑破裂漏出大 量的黑色粉末。受侵染的植株通常变得矮小。 收集上述可疑植物材料等一并带回实验室检验。 9 实验室检测 9.1 鳞茎和寄主残体上病菌的鉴定 选取具有黑粉症状的可疑病斑,用针刺破囊肿,用席尔氏浮载剂制成玻片,在显微镜下观察孢子球 的形态特征。 9.2 种子上病菌的鉴定 9.2.1 制备平均样品 在实验室内将送检样品充分混匀,制成平均样品。 9.2.2 称样 从平均样品中称取50g作为实验样品。 9.2.3 洗涤离心 实验样品倒入经干热灭菌(165℃,1.5h)后的250mL三角瓶内,加蒸馏水100mL,再加表面活性 剂吐温-20(1滴~2滴),用铝铂纸或parafilm膜将三角瓶封口。将三角瓶放在复式振荡器上振荡 5min,立即取下三角瓶,将悬浮液注入干热灭菌的10mL~20mL刻度离心管内离心(1000r/min) 3min。取出离心管,倾去上清液,再加剩余悬浮液,重复离心,直至所有悬浮液离心完毕,留沉淀物。 9.2.4 制片与镜检 离心管中,加入适量席尔氏浮载剂使之悬浮。用可调微量加样器吸取5μL~20μL冬孢子悬浮液 至载玻片上,加盖玻片。制片用冬孢子悬浮液的体积以加盖玻片后悬浮液不外溢为宜。每份试验样品 的冬孢子悬浮液至少镜检5张玻片,每片按视野依次全部检查。观察冬孢子特点,注意观察冬孢子壁的 厚薄,颜色等特征。 9.2.5 孢子球的萌发试验 在离心管中加入适量1%的次氯酸钠溶液,将9.2.3所获得的沉淀物涂于载玻片上,在体视显微镜 下挑取一定数量的冬孢子球放入,用涡旋振荡器混合,消毒5min后,以3000r/min离心1min,立即用 微量加样器吸去上清液,加无菌水离心清洗2次,将冬孢子球沉淀物转至洋葱琼脂培养基(参见附录B) 上培养,条件为13℃~22℃、12h间隙光照、75%的空气湿度,重复3个培养皿。 10 鉴定特征 10.1 寄主植物症状 洋葱、大蒜等鳞茎表面有铅色泡状囊肿,囊肿刺破后有典型的黑粉症状,鳞茎个头小、干腐,发病较 轻的洋葱鳞茎常形成铅色到黑色的瘤肿条斑。洋葱叶片上形成铅色到黑色的有轻微变厚的条斑或水 泡,当增厚区域较大时可引起子叶向下弯曲。随着叶片基部病斑的扩大,病斑破裂漏出大量的黑色粉 末。重病植株通常变得矮小,易死亡。 3GB/T28089—2011 10.2 孢子球特征 冬孢子生在寄主体内,成熟时破裂组织后露出粉状孢子团,黑褐色的粉末状是孢子球。孢子球由一 个冬孢子组成,甚少2个,孢子球球形或椭圆形,直径14μm~25μm,黑褐色,每个单孢的冬孢子周围由 一层直径4μm~8μm的细长的不育细胞包围(参见附录C)。冬孢子球形或广椭圆形,直径10μm~ 16μm,赤褐色,壁光滑。不育细胞无色至淡黄色,半透明的球形,12个~15个,形状和大小一致。 10.3 孢子球萌发生理特性 孢子球在洋葱琼脂培养基上培养2d~3d后进行观察(参见附录C),冬孢子伸出短而半圆形、无色 的先菌丝,先菌丝长到40μm~50μm就停止生长,萌发过程中不产生担孢子,但先菌丝能发生分支,分 支菌丝长到15μm左右就停止生长,分支菌丝不发生融合而产生分隔的菌丝,菌丝上直接形成孢子球, 将萌发后的菌丝转接到洋葱琼脂斜面上保存。 10.4 葱类黑粉病菌与其他近似种的主要区别 葱类黑粉病菌与其他近似种Urocystiscolchici的主要区别参见附录D。 11 结果判定 如寄主植物上具有10.1的症状特征,且黑色分离物具有10.2孢子球特征,鉴定为葱类黑粉病菌。 从种子分离孢子球的特征与10.2、10.3的鉴定特征相吻合,鉴定为葱类黑粉病菌。 12 菌种的保存 将鉴定为葱类黑粉病菌的冬孢子真空保存,经登记和经手人签字后置于4℃左右冰箱中保存,至少 需保存6个月,以备复检、谈判和仲裁。保存期满后,需经灭菌处理。 4GB/T28089—2011 附 录 A (资料性附录) 葱类黑粉病菌相关资料 A.1 分布 非洲:埃及、摩洛哥、加蓬。 亚洲:伊拉克、日本、朝鲜、菲律宾、泰国、印度、伊朗、尼泊尔、中国。 欧洲:奥地利、比利时、英国、保加利亚、捷克、丹麦、法国、德国、希腊、意大利、马耳他、荷兰、挪威、波 兰、罗马尼亚、瑞典、瑞士、匈牙利、芬兰。 大洋洲:澳大利亚、新西兰。 美洲:加拿大、墨西哥、美国、古巴、波多黎各、智利、秘鲁。 A.2 寄主范围 葱属,包括洋葱(Alliumcepa)、大蒜(Alliumporrum)、韭葱(Alliumsativum)、鸦蒜(Allium vineale)等,野生寄主金鱼草属(Antirrhinum)。 A.3 传播方式 该病菌以菌丝和冬孢子的形式在土壤中生存。冬孢子在土壤中存活时间长(20年以上),可通过黏 附在根部表面的土壤、鳞茎的茎基部或鳞茎表面携带的土壤或其他携带土壤的方式作长距离传播,也能 够通过侵染的鳞球茎和植物残体,带菌的运输工具和农具传播。短距离主要靠表面的灌溉水,风吹土 壤,以及人类、野生动物和鸟类的方式传播。冬孢子能够在洋葱种子中发现,但目前还不能确定该病害 是否能够通过种子传播。 5GB/T28089—2011 附 录 B (资料性附录) 洋葱琼脂培养基的制备 B.1 洋葱汁液配方 500g健康洋葱,加水500mL煮沸30min后补足水,取滤液。 B.2 洋葱汁液配制方法 称取琼脂粉15g~20g,加入100mL经消毒的