ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28097—2011 苹 果黑星病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofVenturiainaequalis(Cooke)Wint. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、安徽农业大学、中华人民共和国云南出 入境检验检疫局。 本标准主要起草人:姚剑、檀根甲、温劲松、余晓峰、张萍、李刚、郑海松、李云飞、方元炜、张道环、 李生贵、段禄华。 ⅠGB/T28097—2011 苹果黑星病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了苹果黑星病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于苹果属果树、果实、种苗及其他材料的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 苹果黑星病菌基本信息 中文名:苹果黑星病菌。 学名: 有性型:Venturiainaequalis(Cooke)Wint。 无性型:SpilocaeapomiFr.。 病害英文名:applescab,blackspot。 异名: 有性型:SphaeriacinerascensFr. SphaerellacinerascensFuck. SphaerellainaequalisCooke. Endostigmeinaequalis(Cooke)Syd. Spilostictainaequalis(Cooke)Petr. Endostigmecinerascens(Fleisch)Jorst. 无性型:Fusicladiumdendriticum(Wallr.)Fuck. ClaporiumdendriticumWallr. 根据《真菌词典》第九版(2001),有性型属真菌界Fungi,子囊菌门Ascomycota,子囊菌纲Ascomy- cetes,座囊菌亚纲Dothideomycetidae,格孢腔菌目Pleosporales,黑星菌科Venturiaceae,黑星菌属Ven- turia。 无性型属环黑星孢属Spilocaea,仁果环黑星孢SpilocaeapomiFr.(=Fusicladiumdendriticum (Wallr.)Fuck.)。 苹果黑星病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 经现场查验、取样后,实验室用显微镜等仪器设备进行检测,根据其危害症状、形态学特征进行结果 判定。 1GB/T28097—2011 5 仪器及用具 5.1 仪器 显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、生物培养箱。 5.2 用具 解剖刀、镊子。 6 试剂和培养基 6.1 试剂 4%次氯酸钠,70%酒精。 6.2 培养基 PDA培养基,pH值调节至5.5~6.5。 7 现场检验 7.1 抽样方法 按SN/T2122进行抽样。 7.2 症状检查 逐一对抽检样品进行症状检查,并将疑似感病样品带回实验室作进一步检验。 7.2.1 叶片检查 叶片上病斑多先从叶片正面发生。病原菌从侵入点放射状扩展,形成病斑。叶片正面病斑初为淡 黄绿色,色泽逐渐变深,后变为黑色,圆形、近圆形,直径3mm~6mm或更大,病斑周围有明显的边缘, 老叶上尤甚。幼叶病斑多表面粗糙羽毛状,成叶病斑边缘明显而不整齐,有时表生白色棉絮状物。病斑 多由叶片正面向上突起,其背面形成环状凹入,呈泡斑状,有时病斑脱落穿孔。叶背面侵染形成的病斑 略成圆形,表生黑褐色霉状物,叶片正面对应部位褪绿,枯死。侵染较晚的,仅在叶片背面产生黑色多角 形病斑。叶片上病斑可互相汇合,占据大部叶面,叶片扭曲、卷曲,进而干枯并早期落叶。 在叶柄和主叶脉上的病斑黑色,较小,小点状、梭形或长条形,往往导致叶片变黄脱落。 7.2.2 花器检查 发病花瓣褪色,萼片上生灰色病斑,但常被萼片绒毛覆盖,不易察觉。花梗上病斑还可环切花梗,造 成落花。 7.2.3 果实检查 果实从幼果至成熟期均可被侵染,果面病斑初为黑色星状斑点,很小、微凸,上生有绒状菌丝体。随 着果实膨大,病斑逐渐扩大并凹陷,表层木栓化,边缘开裂,有不规则细小裂纹,整体疮痂状。病果开裂、 畸形。在秋季被侵染的果实,病面密生黑色或褐色小点,不表现典型症状,但在贮藏期病斑逐渐扩大。 2GB/T28097—2011 7.2.4 苗木、接穗等繁殖材料检查 1年生枝条被侵染,常发生在离枝端大于10cm的部位,病斑较小,枝条长大后,病斑消失,但在一 些感病的品种上,病斑并不消失,使病枝呈泡肿状。另外,芽鳞内也有越季存活的菌丝体或分生孢子。 8 实验室检测 8.1 切片检测 选取疑似感病植物组织病健交界处切片,移于载玻片中央的水滴中,镜检,观察子实体特征。 8.2 分离培养检测 选取疑似感病植物组织,剪取病健交界处组织若干小块,约2mm×2mm,在70%酒精中浸湿一下 后立即移入4%次氯酸钠中消毒处理1min,用无菌水洗3次,放于PDA平板培养基上,每皿5块,置于 16℃~20℃,光照强度为600lx、光周期为12h条件下培养。观察病菌形态特征。 9 鉴定特征 9.1 病菌形态特征 苹果黑星病菌有性型Venturiainaequalis(Cooke)Wint.子囊座在落叶上形成,埋生或近表生叶肉 组织中,黑褐色,球形、近球形,直径约90μm~100μm,孔口处稍有乳状突起,具刚毛,刚毛长25μm~ 75μm。子囊座内产生多数子囊,处于不同发育阶段。子囊长棍棒形,无色,大小(55μm~75μm)× (6μm~12μm),有短柄,壁薄。子囊内含8个子囊孢子,成熟子囊孢子卵圆形,暗褐色,双胞,顶细胞较 小,基部细胞较大,大小(11μm~15μm)×(4μm~8μm)。无性型Fusicladiumdendriticum (Wallr.)Fuck.分生孢子梗丛生、淡褐色至橄榄色,短棒状,直立或弯曲,不分枝,单胞,0个~2个隔膜, 全壁芽生产孢,环痕式延伸,大小(50μm~60μm)×(4μm~6μm)。分生孢子顶生,倒梨形或倒棍棒 状,顶端略尖,初无色,淡褐色至橄榄色,初单胞,后生1个隔膜,隔膜处稍缢缩,孢基平截,表面光滑或具 小疣突,大小(12.0μm~26.0μm)×(5.5μm~11.5μm)。分离培养的分生孢子比切片观察的略大 (参见附录B)。 9.2 病菌培养性状 菌株在PDA培养基上培养4d后,开始形成灰白色菌落。4周后,菌落呈不规则形或圆形,直径约 20mm,平铺状,橄榄色、灰色或黑色,有时被茸毛。菌丝初无色,后变为橄榄色。 9.3 与梨黑星病菌Venturiapirina(Cooke)Adh.的区别 梨黑星病菌有性型孢子囊棍棒形,子囊孢子顶细胞较大,基部细胞较小;无性型分生孢子梗罕见有 隔膜,梗壁上有齿状或疣状突起,分生孢子单孢,两端略尖(参见附录C)。 10 结果判定 如有7.2.1~7.2.4描述中任一症状,且切片或分离培养观察的病菌形态特征与描述的病原有性型 或无性型特征相符,可判定为苹果黑星病菌。 3GB/T28097—2011 11 样品、菌种保藏 分离菌转接在PDA培养基斜面上,待斜面表面长满菌丝后,置于4℃保存,定期转椄。有条件可进 行冷冻干燥保存。 检出病菌的样品妥善保存6个月。保存期满灭活处理。 4GB/T28097—2011 附 录 A (资料性附录) 苹果黑星病菌其他信息 A.1 地理分布 美洲:墨西哥、美国、加拿大、阿根廷、巴西、智利;欧洲:芬兰、英国、法国、奥地利、德国、前苏联、捷 克、斯洛伐克、波兰、保加利亚、匈牙利、罗马尼亚、前南斯拉夫、比利时、意大利、丹麦、荷兰、挪威、瑞典、 瑞士、土耳其;亚洲:印度、日本、朝鲜、阿富汗、叙利亚、塞浦路斯以及中国(吉林、黑龙江、新疆、四川、云 南等);非洲:南非、肯尼亚、利比亚;大洋洲:澳大利亚、新西兰等。 A.2 寄主范围 主要为苹果属果树(Malus)。 5GB/T28097—2011 附 录 B (资料性附录) 苹果黑星病菌形态特征 图B.1 无性型分生孢子梗及分生孢子 图B.2 有性型子囊和子囊孢子 6GB/T28097—2011