ICS13.100 C60 中华人民共和国国家标准 GB/T28236—2011 染 色体畸变估算生物剂量方法 Methodofchromosomeaberrationanalysisfor biologicaldoseassessment 2011-12-30发布 2012-05-01实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准代替GB/T12715—1991《染色体畸变分析估算生物剂量的方法》。 本标准与GB/T12715—1991相比主要变化如下: ———补充了标准的范围“也适用于一次比较均匀的全身外照射复合烧伤的病例的生物剂量估算”; ———将可较准确估算剂量的取血时间改成60d: ———强调采用培养开始加秋水仙素法和用dic(或“dic+r”)估算剂量; ———增加了不均匀和局部照射的统计检验和生物剂量估算方法; ———原标准基本是引用IAEA第260号技术报告丛书(1986),本标准尽量采用我国的资料,如染色 体畸变图、生物剂量估算的举例、某些统计分析方法、取血有效时间和估算剂量的注意事项等。 同时,也参考和引用了IAEA第405号技术报告丛书(2001)的有关内容。 本标准附录A是规范性附录,附录B是资料性附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所。 本标准主要起草人:白玉书。 本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为:GB/T12715—1991。 ⅠGB/T28236—2011 染色体畸变估算生物剂量方法 1 范围 本标准给出了电离辐射诱发人外周血淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线的建立和用其估算生 物剂量的方法。 本标准适用于一次比较均匀的全身外照射事故受照人员的剂量估算。 本标准也适用于一次比较均匀的全身外照射复合烧伤的病例剂量估算。 本标准不适用于分次照射、长期小剂量累积照射和内照射的生物剂量估算。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 生物剂量计 biologicaldosimeter 用以估算受照剂量的生物体系,该生物体系受到照射后的反应与受照剂量之间存在着某种定量关 系,从而可用来推定受照剂量。 2.2 剂量-效应曲线 dose-responsecurve 某种物质或生物体系受到照射后的反应与受照剂量之间存在着某种定量关系,可将二者拟合成适 当的数学模式,并制备出相应的刻度曲线,称之为剂量-效应曲线,可用其估算受照剂量。 2.3 染色体 chromosome 基因的载体。存在于细胞核内,当细胞分裂时,在碱性染料作用下着色较深。由脱氧核糖核酸 (DNA)、蛋白质和少量核糖核酸(RNA)组成。 2.4 染色体畸变 chromosomeaberration 正常染色体在物理、化学或生物等因素作用下发生的结构和数目上的异常。 2.5 染色体型畸变 chromosome-typeaberration 照射时处于Go或G1期的细胞,由于在DNA合成之前,染色体以一条单体行使其功能,这时诱发 的畸变,经S期复制后,形成涉及两条单体的染色体型畸变,主要包括无着丝粒断片、微小体、无着丝粒 环、着丝粒环、双或多着丝粒体、倒位、易位、插入和缺失等。 2.6 染色单体型畸变 chromatid-typeaberration 在S期受照的大多数细胞和G2期受照的细胞,已进行DNA合成,即已形成两个独立的单体。所 以只诱发染色单体型畸变,主要包括染色单体断裂、染色单体互换、染色单体间隙和等染色单体间隙等。 2.7 非稳定性染色体畸变 unstablechromosomeaberration 非稳定性染色体畸变包括无着丝粒断片、微小体、无着丝粒环、双着丝粒体和着丝粒环。 无着丝粒断片、微小体、无着丝粒环,由于无着丝粒,在纺锤体上不能定向,很快从分裂细胞中丢失。 双着丝粒体和着丝粒环往往在分裂后期形成染色体桥或导致四倍体而常引起细胞死亡,将上述五种畸 1GB/T28236—2011 变称为非稳定性畸变。 2.8 稳定性染色体畸变 stablechromosomeaberration 倒位、易位、插入和缺失等畸变,在细胞分裂时不存在任何力学上的障碍,细胞复制不受影响,可较 长时间在体内存在,称之为稳定性畸变。 3 试剂配制、细胞培养和标本制备 3.1 试剂配制 3.1.1 培养液配制 3.1.1.1 取RPMI-164010.4g(原包装),溶于800mL去离子水中。 3.1.1.2 于上述培养液中加入抗生素,其终浓度为:青霉素100IU/mL,链霉素100IU/mL。 3.1.1.3 用5%的NaHCO3溶液将培养液的pH调到7.2,充分混匀后0.22μm过滤除菌。 3.1.1.4 加入灭活的新生牛血清200mL,使其浓度占培养液总量的20%。 3.1.1.5 将上述培养液充分混匀后,分装到灭菌的培养瓶中,每瓶4mL,置入-20℃低温冰箱保存 备用。 3.1.2 0.2%肝素溶液 称取200mg肝素钠粉溶于100mL生理盐水中,55.12kPa灭菌15min。 3.1.3 秋水仙素溶液(分子式:C22H25O6N,分子量:399) 称取秋水仙素100mg,溶于100mL生理盐水(1mg/mL)即为原液,分装成小瓶,低温保存。应用 时配制成2.5μg/mL。 3.1.4 PHA干粉 按使用说明配制。 3.1.5 0.075mol/LKCl低渗液 称取5.60gKCl溶于1000mL去离子水中,放入37℃恒温箱中备用。 3.1.6 Giemsa染液 Giemsa染料 0.5g 中性甘油(CP) 33.0mL 甲醇(AR) 33.0mL 先将Giemsa染料放入乳钵中,加甘油后研磨片刻,移入小烧杯内,放置55℃~60℃水浴箱中2h, 用玻璃棒搅拌,溶解后加入33mL甲醇即为原液,用前按Giemsa∶PBS=1∶20稀释。 3.2 细胞培养和标本制备 3.2.1 培养开始加秋水仙素法 3.2.1.1 将冰冻保存的培养液取出,室温下融化。 3.2.1.2 用肝素溶液湿润灭菌注射器后,抽取静脉血,于每瓶组合培养液内加入0.4mL抗凝血,平行 接种2瓶,对过量受照者的样品接种不少于3瓶。根据有关信息,估计受照剂量较大(>5Gy)者,接种 不少于6瓶。 3.2.1.3 加入PHA,加入量按使用说明确定。 3.2.1.4 加入秋水仙素,最终浓度为0.04μg/mL。 3.2.1.5 混匀,标记姓名、日期,置入37℃恒温箱培养。 3.2.1.2~3.2.1.5的操作必须在无菌条件下进行。 3.2.1.6 培养48h~50h,取出培养瓶,去上清液。 3.2.1.7 加入0.075mol/LKCl低渗液8mL,混匀,低渗10min。 3.2.1.8 加入固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)1mL预固定。 2GB/T28236—2011 3.2.1.9 1000r/min离心10min,去上清,再加固定液8mL,混匀。 3.2.1.10 固定20min,再离心10min,去上清,重复固定一次。 3.2.1.11 冰干法制片,每片滴3滴沉淀物,过火一燃即可。 3.2.1.12 干燥后Giemsa染色。 3.2.2 荧光加姬姆萨(FPG)技术 3.2.2.1 将冰冻保存的培养液取出,室温下融化。 3.2.2.2 用肝素溶液湿润灭菌注射器后,抽取静脉血,于每瓶组合培养液内加入0.4mL抗凝血,平行 接种2瓶,对过量受照者接种不少于3瓶。对估计受照剂量较大(>5Gy)者,接种不少于6瓶。 3.2.2.3 加入PHA,加入量按使用说明确定。 3.2.2.4 加Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷),最终浓度为15μg/mL。 3.2.2.2~3.2.2.4的操作必须在无菌条件下进行。 3.2.2.5 混匀,标记姓名、日期,置入37℃恒温箱避光培养46h加秋水仙素,继续培养至48h~50h 收获。 3.2.2.6 制片后用荧光染料处理。将标本浸入浓度为2.5μg/mL的Hoechst33258溶液(避光), 40min后用蒸馏水冲洗。 3.2.2.7 晾干后往标本上滴加2×SSC溶液,标本所在玻璃板温度为50℃~60℃,用黑光灯或紫外线 灯照射30min。 3.2.2.8 晾干后Giemsa染色。 4 剂量-效应曲线的建立方法 4.1 照射条件和培养方法 4.1.1 必须提供可靠的、明确的样品照射的物理剂量。受照标本应与照射源保持一定的距离以达到均 匀照射的目的。有条件的实验室应建立包括不同辐射类型(如X射线、γ射线、中子)、不同剂量率(低 LET辐射)的剂量-效应曲线。在0.1Gy~5.0Gy剂量范围内,剂量率最好大于0.3Gy/min,小于 1.0Gy/min,至少要选择8个剂量点。 4.1.2 选择2~3名成年健康人血样,在37℃±0.5℃条件下进行离体照射,照后在上述温度下放置 2h,然后采用培养开始加秋水仙素法或FPG技术培养,得到可供分析的第一次有丝分裂(M1)细胞,如 果采用前种方法,其秋水仙素浓度对分裂中期细胞的有效阻断率必须达到99%以上。 4.2 计数分析技术 4.2.1 在分析M1细胞时,只记录染色体型畸变中的非稳定型畸变: a) 无着丝粒畸变(acentrics,ace)是一对无着丝粒的姐妹染色单体,包括无着丝粒断片、微小体和 无着丝粒环。无着丝粒断片(acentricfragments,f),又称末端缺失,是一对相互平行的染色单 体,有时易与等染色单体间隙相混淆,其判断标准是:如果两断端距离小于染色单体横径,视为 等